一種基于活性篩選的牡丹皮藥材及制劑檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于活性篩選的牡丹皮藥材及制劑檢測方法，屬于中醫(yī)藥研宄方 法學領域。
【背景技術】
[0002] 目前國內(nèi)外中藥藥材、中間體、制劑質量控制的方法是在化學成分研宄的基礎上， 建立中藥中的某一或兩個有效成分（主成分）的定性、定量分析方法，進而控制中藥的質 量。但這種質量控制方法未能體現(xiàn)中藥整體特點，也未能給出這些質控指標與藥效相關的 證據(jù)，更值得關注的是這些成分的質量控制不是越高越好，而是不同的成分應該控制在一 定范圍比例內(nèi)，即"組分結構"。很多研宄案例結果顯示中藥（復方）的最佳藥效是多種藥 材或組分之間組成結構的生物學反映。
[0003] 牡丹皮為雙子葉植物，是毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的干燥的 根皮。產(chǎn)于安徽、四川、河南、山東等地。牡丹皮始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，具有清熱 涼血、活血化淤、退虛熱等功效?，F(xiàn)代學者對牡丹皮的化學成分進行了許多藥理效應研宄， 認為其具有心血管系統(tǒng)作用、保肝、降血糖、降血脂、降血壓等作用，還具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)作 用。對牡丹皮及其產(chǎn)品的質量控制，2010年《中國藥典》質量控制標準規(guī)定藥材含丹皮酚不 得少于1. 2%，該質控標準不能客觀準確反應牡丹皮的藥材質量。在《中國藥典》中收錄的 近40種成方制劑，對于牡丹皮藥材來說，質控指標僅一個或不涉及。
[0004] 本技術基于活性成分的篩選，結合主成分分析、聚類分析等手段，揭示了牡丹皮藥 材、中間體、制劑的組成結構特征，確定多成分指標的質控范圍，為牡丹皮藥材及制劑提供 一種多組分質量控制方法。
【附圖說明】
[0005] 圖1腎系膜細胞固相化牡丹皮提取物產(chǎn)物色譜圖（A)及化學結構圖（B)，其中（a) 牡丹皮孵育液；(b)最后一次PBS洗滌液；（c)空白解離液；（d)固相化產(chǎn)物解離液
[0006] 圖2牡丹皮提取物抑制AGES生成色譜圖（A)及化學結構圖（B)，其中（a)牡丹皮 孵育液；(b)丙酮醛孵育液；（c)牡丹皮與丙酮醛孵育液
[0007]圖3牡丹皮提取物抑制血小板聚集生成色譜圖（A)及化學結構圖（B)，其中（a)牡 丹皮孵育液；(b)最后一次PBS洗滌液；（c)空白解離液；（d)固相化產(chǎn)物解離液
[0008] 圖4HPLC法測定的不同產(chǎn)地牡丹皮（A)及成分聚類分析結果（B)，注：從前向后依 次為湖南、安徽、甘肅、重慶、四川、貴州、河南、河北、浙江、山東產(chǎn)地的牡丹皮吸收峰。
[0009] 圖5效應物質對AGES誘導的SOD活性（A)及MDA含量⑶的影響
[0010] 圖6效應物質系膜細胞FN蛋白表達的影響
[0011] 圖7效應物質血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響，其中：a，200yg/mL牛血清白蛋白；b，200yg/mLAGEs;c,氨基胍（10yM) +200yg/mLAGEs;d,丹皮酚pae(10-4M) +200yg/ mLAGEs;e,三沒食子酰葡萄糖（10-4M)+200yg/mLAGEs;f,五沒食子酰葡萄 糖（10-4M)+200yg/mLAGEs;g,芍藥苷（10-4M)+200yg/mLAGEs;h,氧化芍藥苷 (10-4M) +200yg/mLAGEs;i,苯甲酰芍藥苷（10-4M) +200yg/mLAGEs.AGEs組和BSA組相 比，###p〈〇. 〇〇l;樣品組與AGEs組相比，*P〈0. 05, #P〈0. 01, *#P〈0. 001。
[0012] 圖8牡丹皮藥材、中間體、配方顆粒6個有效成分HPLC色譜圖
[0013] 圖9不同產(chǎn)地牡丹皮對腎系膜細胞ICAM-1、TGF-M和FN表達的影響及藥效聚類 分析

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 解決的技術問題：
[0015] 本發(fā)明針對牡丹皮藥材、中間體及制劑產(chǎn)品的質量檢測現(xiàn)狀，提供一種基于高效 液相色譜法的牡丹皮藥材、中間體及制劑產(chǎn)品質量檢測方法，通過主成分分析和聚類分析 統(tǒng)計方法，獲得主要的質控指標，并經(jīng)藥理活性評估證明其有效，確定指標成分的控制范 圍，為一種基于活性篩選的牡丹皮藥材及制劑檢測方法。
[0016] 技術方案：
[0017] 基于中醫(yī)藥整體性特點，采用現(xiàn)代活性成分篩選技術篩選牡丹皮藥材中多個活性 成分，結合數(shù)理統(tǒng)計聚類分析和主成分分析，確定與藥效相關的6個主要成分，經(jīng)抗AGEs 誘導的腎系膜細胞和血管內(nèi)皮細胞的活性評估，并確定這些成分的組成結構特征及檢測范 圍，對其藥材、中間體、制劑產(chǎn)品進行質量檢測。
[0018] 本發(fā)明提供的一種基于活性篩選的牡丹皮藥材及制劑檢測方法，其主要包括以下 步驟：
[0019] (1)采用細胞膜固相色譜技術和糖基化產(chǎn)物共孵育體系篩選與血小板、腎系膜細 胞、抑制糖基化產(chǎn)物生成的成分，并對這些成分進行辨識和解析，確定13個成分。
[0020] (2)根據(jù)步驟（1)采取聚類分析根據(jù)成分進行聚類分析，并采用主成分分析確定6 個與藥效活性相關的主成分。
[0021] (3)根據(jù)步驟⑵中確定的6個活性成分，評價其對抗糖基化產(chǎn)物AGES對腎系膜 細胞和血管內(nèi)皮細胞損傷的保護活性。
[0022] (4)根據(jù)步驟⑵和⑶中確定的6個活性成分，建立檢測牡丹皮藥材、中間體及 制劑的HPLC條件：
[0023] a.液相色譜條件：色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：乙腈 (A)-0? 1 % 甲酸水溶液（B)，梯度洗脫條件：0-20min，5 % -10 %A;20-30min，10 % -10 %A; 30-80min，10 % -18 %A;80-120min，18 % -50 %A;檢測波長 254nm，流速 0? 8mL/min，柱溫 25 °C。
[0024] b.對照品溶液的制備：分別精密稱取恒重的對照品氧化芍藥苷、芍藥苷、三沒食 子酰葡萄糖、五沒食子酰葡萄糖、苯甲酰芍藥苷和丹皮酚適量，加60%甲醇溶液分別制成每 lmL含芍藥苷72. 15yg、氧化芍藥苷59. 56yg、三沒食子酰葡萄糖89. 35yg、五沒食子酰葡 萄糖109. 76yg、苯甲酰芍藥苷137. 67yg和丹皮酚86. 23yg，用甲醇定容至刻度，搖勻；另 各取lmL配成混合對照品溶液。
[0025] c.供試品溶液的制備
[0026]牡丹皮藥材供試品溶液的制備：精密稱定牡丹皮藥材粉末約0. 5g，置50mL容量瓶 中，加75%乙醇（v/v)20mL，超聲或回流處理30min(兩次），取出，放冷，合并濾液，加75% 乙醇定容至50mL刻度，搖勻，經(jīng)0. 45ym的微孔濾膜濾過，即得；
[0027] 牡丹皮提取物供試品溶液的制備：精密稱定牡丹皮提取物0.lg，置50mL容量瓶 中，加75%乙醇（v/v)20mL，超聲或回流處理30min(兩次），取出，放冷，合并濾液，加75% 乙醇定容至50mL刻度，搖勻，經(jīng)0. 45ym的微孔濾膜濾過，即得；
[0028] 牡丹皮制劑供試品溶液的制備：精密稱定牡丹皮制劑粉末約0. 25g，置50mL容 量瓶中，加75%乙醇（v/v) 20mL，超聲或回流處理30min(兩次），取出，放冷，合并濾液，加 75%乙醇定容至50mL刻度，搖勻，經(jīng)0. 45ym的微孔濾膜濾過，即得；
[0029] d.測定法：高效液相色譜儀分析對照品和供試品溶液，進樣體積10yL。
[0030] (5)根據(jù)步驟（4)中建立的HPLC檢測方法，結合藥效分析和聚類分析，確定質量檢 測范圍。
[0031] 有益效果：針對牡丹皮藥材、中間體及制劑產(chǎn)品的質量檢測缺點，本發(fā)明基于活性 篩選，結合數(shù)理統(tǒng)計方法，確定主成分，利用高效液相色譜同步檢測技術，建立氧化芍藥苷、 芍藥苷、三沒食子酰葡萄糖、五沒食子酰葡萄糖、苯甲酰芍藥苷和丹皮酚含量同步測定方 法，并確定最佳控制范圍，進一步保證牡丹皮藥材藥材、中間體、制劑產(chǎn)品的質