超支化聚縮水甘油醚修飾膠乳微球增強(qiáng)免疫比濁法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測試劑領(lǐng)域，涉及超支化聚縮水甘油醚修飾膠乳微球增強(qiáng)免疫 比濁法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 免疫比池法（ImmunoturbidimetricAssays)是抗原抗體結(jié)合動態(tài)測定方法。其 基本原理是：當(dāng)抗原與抗體在特殊稀釋系統(tǒng)中反應(yīng)而且比例合適（一般規(guī)定抗體過量）時， 形成的可溶性免疫復(fù)合物在稀釋系統(tǒng)中的促聚劑（聚乙二醇等）的作用下，自液相析出，形 成微粒，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。當(dāng)抗體濃度固定時，形成的免疫復(fù)合物的量隨著檢樣中抗原量 的增加而增加，反應(yīng)液的濁度也隨之增加。通過測定反應(yīng)液的濁度與一系列標(biāo)準(zhǔn)品對照，即 可計算出檢樣中抗原的含量。
[0003] 一般免疫比濁可分為以下幾類：
[0004] 免疫透射比濁法：抗原抗體結(jié)合后，形成免疫復(fù)合物，在一定時間內(nèi)復(fù)合物聚合出 現(xiàn)濁度。當(dāng)光線通過溶液時，可被免疫復(fù)合物吸收。免疫復(fù)合物量越多，光線吸收越多。光 線被吸收的量在一定范圍內(nèi)與免疫復(fù)合物的量成正比。利用比濁計測定光密度值，復(fù)合物 的含量與光密度值成正比，同樣當(dāng)抗體量一定時，光密度值也與抗原含量成正比。本法較單 向瓊脂擴(kuò)散試驗和火箭電泳等一般免疫化學(xué)定量方法敏感、快速簡便，但要求免疫復(fù)合物 的數(shù)量和分子量達(dá)到一定高度，否則就難以測出。
[0005] 免疫散射比濁法：一定波長的光沿水平軸照射，通過溶液使遇到抗原抗體復(fù)合物 粒子，光線被粒子顆粒折射，發(fā)生偏轉(zhuǎn)，光線偏轉(zhuǎn)的角度與發(fā)射光的波長和抗原抗體復(fù)合物 顆粒大小和多少密切相關(guān)。散射光的強(qiáng)度與復(fù)合物的含量成正比，即待測抗原越多，形成的 復(fù)合物也越多，散射光也越強(qiáng)。散射光的強(qiáng)度還與各種物理因素，如加入抗原或抗體的時 間、光源的強(qiáng)弱和波長、測量角度等密切相關(guān)。散射比濁法又分為速率散射比濁法和終點散 射比濁法。
[0006] 免疫膠乳比濁法：膠乳比濁法即是將待測物質(zhì)相對應(yīng)的抗體包被在膠乳顆粒上， 使抗原抗體結(jié)合物的體積增大，光通過之后，透射光和散射光的強(qiáng)度變化更為顯著，從而提 高試驗的敏感性。
[0007] 膠乳顆粒增強(qiáng)比池法（particle-enhancedturbidimetricimmunoassay,PETIA) 是近年來出現(xiàn)的一種較為穩(wěn)定、準(zhǔn)確的體液蛋白均相免疫比濁檢測方法。PETIA法大體分 為兩種。一種是散射比濁檢測法；另一種是透射比濁檢測法。這兩種方法的基本原理非常 相似，都是在高分子膠乳微球的表面交聯(lián)單克隆抗體，當(dāng)交聯(lián)有抗體的微球與抗原結(jié)合后， 在短時間內(nèi)會迅速聚集在一起，改變了反應(yīng)液的散光性能或透光性能。而且，反應(yīng)液散光性 能或透光性能（即吸光度）的改變與被測抗原的濃度有較強(qiáng)的相關(guān)性，在一定范圍內(nèi)可以 反映被測抗原的濃度。PETIA檢測方法是在均相反應(yīng)體系中進(jìn)行抗原、抗體反應(yīng)及結(jié)果的測 定?？乖?、抗體反應(yīng)后，直接測定反應(yīng)液的吸光度值，省卻了ELISA法反復(fù)孵育和洗板等煩 瑣操作步驟，幾分鐘就能獲得結(jié)果，省時省力。此外，免疫比濁法操作步驟的簡化也相應(yīng)地 避免了許多人為操作因素和試劑、環(huán)境等外界因素的干擾，穩(wěn)定性和重復(fù)性都較好，能較真 實地反映被測物質(zhì)的含量。免疫比濁法的靈敏度雖然比ELISA法差一些，但足于檢測到健 康人血漿中許多標(biāo)志蛋白的下限值，可完全滿足臨床檢測要求。
[0008] 目前，PETIA檢測試劑所采用的膠乳顆粒多為惰性微球、羧基化微球及氨基化微 球。表面修飾的膠乳粒子與抗體的結(jié)合是通過其表面的羧基或氨基與抗體的氨基端共價結(jié) 合，在微球與抗體之間有一個橋聯(lián)化學(xué)臂，降低了位阻效應(yīng)，不僅提高了抗體的結(jié)合率，而 且還為抗體提供合適的三維空間立體結(jié)構(gòu)，有效地保護(hù)了抗體與抗原結(jié)合的活性區(qū)域。檢 測的靈敏度得到了極大的改善，檢測靈敏度最高可達(dá)到l.〇ng/ml?？梢宰鳛槎嗫寺】贵w和 單克隆抗體的載體。中國專利CN102645537公開了一種用于診斷胃病或胃癌的膠乳增強(qiáng)免 疫比濁試劑盒，包括稀釋液、含有胃蛋白酶I或胃蛋白酶II的抗體的膠乳試劑和空白液，其 中所述的膠乳試劑含有偶聯(lián)了胃蛋白酶I或胃蛋白酶II的抗體的不同粒徑的聚苯乙烯納 米微球；專利CN103777023公開了一種納米膠增強(qiáng)免疫比濁法測定脂聯(lián)素的試劑盒，包括 R1試劑、R2試劑和脂聯(lián)素抗原校準(zhǔn)品溶液，其中R1試劑包括電解質(zhì)、穩(wěn)定劑、表面活性劑、 防腐劑和緩沖液；R2試劑包括偶聯(lián)抗體的膠乳顆粒、電解質(zhì)、穩(wěn)定劑、表面活性劑、防腐劑 和緩沖液；所述膠乳顆粒為苯乙烯和丙烯酸聚合而成的共聚物。上述兩種膠乳增強(qiáng)免疫比 濁法都具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性高的特點。
[0009] 但是隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)診斷手段的發(fā)展，對于疾病的早期預(yù)防和控制要求越來越細(xì) 致，疾病的早期診斷以及分期成為越來越受人重視的研宄方向，小微型的待測樣本的測定 成為一種新趨勢，在這種情況下，有時候上述傳統(tǒng)膠乳增強(qiáng)免疫比濁法所用的材料往往達(dá) 不到所需要的檢測下限和檢測下限，運(yùn)用新的材料成為一種必然趨勢。
[0010] 聚乙二醇（PEG)是在生物醫(yī)藥方向中使用非常廣泛的一個親水性物質(zhì)，其生物相 容性以及非免疫源性的特征使得在它在很多領(lǐng)域作為改性材料使用，例如抗體、蛋白、核 苷酸、脂質(zhì)體的修飾，聚合物和聚合物微球的表面改性等。在免疫分析中，納米粒子表面的 PEG可以有效的降低非特異性吸附，減少本底值，提高反應(yīng)的靈敏度，降低假陽性和假陰性 結(jié)果。但是線性的PEG聚合物由于其結(jié)構(gòu)中只在聚合物端基部分有官能團(tuán)，因此整個聚合 物結(jié)構(gòu)中只有一個或者兩個活性位點可供于偶聯(lián)，結(jié)合能力較弱，偶聯(lián)效率不高，這點限制 了其更廣泛的應(yīng)用。
[0011] 與線性聚合物不同，超支化聚合物（支化程度至少大于等于2)在結(jié)構(gòu)分支處包含 較多的官能團(tuán)。超支化聚合一般有較好的溶解性，溶解后粘度較低和流動性也較好，使用上 簡單方便。再者，超支化聚合物合成方法也比較簡單，主要分成三種：第一，利用多官能團(tuán)的 單體縮聚制備；第二，在已經(jīng)制備好的聚合物前驅(qū)體中進(jìn)行接枝修飾，第三，利用環(huán)氧的開 環(huán)反應(yīng)來制備超支化的結(jié)構(gòu)。
[0012] 超支化聚縮水甘油醚是一種特殊的超支化聚合物，有著類似聚乙二醇的主鏈結(jié) 構(gòu)，在支鏈結(jié)構(gòu)上富含羥基，這部分羥基一方面為化學(xué)偶聯(lián)提供了大量結(jié)合位點，另一方面 又給聚合物帶來了良好的親水性能。這些結(jié)構(gòu)特點使超支化聚縮水甘油醚具有大量的末端 官能團(tuán)，擁有良好的生物相容性、高溶解性和高流變性。專利CN101774628公開了一種水溶 性金屬硫化物半導(dǎo)體納米粒子的制備方法，專利CN101774630公開了一種水溶性鹵化銀納 米粒子的制備方法，都說明了超支化聚縮水甘油醚具有良好的親水效果，具有大量的末端 官能團(tuán)。
[0013] 所以利用超支化聚縮水甘油醚修飾膠乳微球應(yīng)用于免疫比濁分析上，由于其大量 的末端官能團(tuán)效應(yīng)，可以大大加強(qiáng)免疫分析中抗原抗體結(jié)合效率和形成聚合物出現(xiàn)濁度， 能夠極大的增強(qiáng)分析的靈敏度。目前，還沒有相關(guān)超支化聚縮水甘油醚修飾膠乳微球在增 強(qiáng)免疫比濁上的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種超支化聚縮水甘油醚修飾膠 乳微球增強(qiáng)免疫比濁法。
[0015] 本發(fā)明的另一目的是提供一種超支化聚縮水甘油醚修飾膠乳微球增強(qiáng)免疫比濁 試劑盒。
[0016] 本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0017] -種超支化聚縮水甘油醚修飾膠乳微球增強(qiáng)免疫比濁法，其特征在于包括以下方 法：
[0018] 方法一：超支化聚縮水甘油醚經(jīng)修飾后包被在膠乳微球表面形成超支化聚縮水甘 油醚修飾膠乳微球，對超支化聚縮水甘油醚修飾膠乳微球的端基進(jìn)行活化后偶聯(lián)能與待測 分子特異性結(jié)合的探測分子，形成了超支化聚縮水甘油醚修飾膠乳微球?探測分子復(fù)合 物，將超支化聚縮水甘油醚修飾膠