β-受體阻斷劑均相酶免疫檢測(cè)試劑及其制備和檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種3 -受體阻斷劑檢測(cè)試劑及其制備和檢測(cè)方法，具體涉及一種 3-受體阻斷劑均相酶免疫檢測(cè)試劑及其制備和檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 0 -受體阻斷劑（BetaBlockers)全稱為0 -腎上腺素能受體阻斷劑，主要通過阻 斷@ -受體（0 1-受體或0 2-受體）與兒茶酚胺類物質(zhì)的結(jié)合，從而對(duì)心血管系統(tǒng)、代謝 系統(tǒng)、支氣管平滑肌等施予調(diào)節(jié)作用。受體阻斷劑的出現(xiàn)是近代藥理學(xué)的一項(xiàng)重大進(jìn) 展。1962年第一種受體阻斷劑普萘洛爾（心得安）問世并應(yīng)用于臨床實(shí)踐。至今，全 世界已合成的受體阻斷劑數(shù)以千計(jì)，被批準(zhǔn)用于人類疾病治療并已生產(chǎn)上市者也已有 幾十種。目前，最常用的受體阻斷劑包括：普萘洛爾、阿替洛爾、美托洛爾、吲哚洛爾以 及比索洛爾等數(shù)十種。0 _受體阻斷劑主要用于治療慢性心力衰竭、心絞痛、心肌梗死、高 血壓、心律失常、高動(dòng)力心臟綜合征、肥厚型心肌病、冠狀動(dòng)脈疾病、二尖瓣狹窄以及3 -受 體功能亢進(jìn)癥等多種心血管疾病。此外，受體阻斷劑還可用于馬凡綜合征、甲狀腺機(jī)能 亢進(jìn)癥、青光眼等其它疾病的防治。0 -受體阻斷劑問世50多年來，其應(yīng)用經(jīng)久不衰，臨床 適應(yīng)癥范圍不斷拓寬，療效更好的新品種不斷涌現(xiàn)，使其在人類心血管疾病及其它多種疾 病的治療中起到十分重要的作用，正因?yàn)槿绱?，受體阻斷劑（心得安）的發(fā)明者James Black獲得了 1988年的諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。
[0003] 由于0 -受體阻斷劑可用來提高運(yùn)動(dòng)成績，因此國際奧委會(huì)將此類藥物列為禁用 藥物。對(duì)受體阻斷劑的檢測(cè)分析不僅在臨床藥物濃度監(jiān)測(cè)、生物利用度分析、藥代動(dòng)力 學(xué)研究等方面有重要意義，而且在體育比賽的賽后尿檢中也具有重要價(jià)值。0 -受體阻斷 劑的分析測(cè)定多是針對(duì)生物樣本中的原型藥和代謝物進(jìn)行的，目前國內(nèi)外常用的測(cè)定方法 有：氣-液色譜法、高效液相色譜法、反相液相色譜法、氣相色譜法、質(zhì)譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法、液 相串聯(lián)質(zhì)譜法、熒光分光光度法、薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法、碳糊電極法、放射免疫分析法 等，這些方法各有其特點(diǎn)及優(yōu)劣，但是都不適用于大批量臨床樣本的快速檢測(cè)，并且常用的 檢測(cè)方法只能針對(duì)單一的一種受體阻斷劑進(jìn)行測(cè)定。目前市場(chǎng)上還沒有一款能同時(shí)測(cè) 定多種常見的受體阻斷劑，且穩(wěn)定性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)的受體阻斷劑檢測(cè)試 齊U，尤其是質(zhì)量好的自動(dòng)化檢測(cè)試劑，因此，研發(fā)生產(chǎn)質(zhì)量達(dá)到臨床要求、實(shí)用性強(qiáng)、性價(jià)比 高，可應(yīng)用于全自動(dòng)生化分析儀的受體阻斷劑測(cè)定試劑已成為國內(nèi)外體外診斷試劑行 業(yè)的熱點(diǎn)。
[0004] 吲哚洛爾是一種具有0 -受體阻斷劑類藥物典型結(jié)構(gòu)的常用藥物，其結(jié)構(gòu)式如式(IV)所示：
[0005]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種β-受體阻斷劑均相酶免疫檢測(cè)試劑，其特征在于，包括：抗β-受體阻斷劑特 異性抗體、用于檢測(cè)抗β -受體阻斷劑特異性抗體-β -受體阻斷劑復(fù)合物的指示試劑；上 述β-受體阻斷劑包括吲哚洛爾、比索洛爾、阿替洛爾、美托洛爾和普萘洛爾中的一種或多 種；上述抗β -受體阻斷劑特異性抗體由吲哚洛爾免疫原免疫動(dòng)物得到，吲哚洛爾免疫原 的結(jié)構(gòu)式如式（I )所示：
式中，R為連接基團(tuán)-(CH2)n-COO-, η為1至20之間的任意整數(shù)，載體為具有免疫原性 的蛋白質(zhì)，載體為血清蛋白、血藍(lán)蛋白或甲狀腺球蛋白；上述指示試劑選自酶試劑、放射性 同位素試劑、突光試劑或化學(xué)發(fā)光試劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的β-受體阻斷劑均相酶免疫檢測(cè)試劑，其特征在于，R 為-(CH2)3-COO'
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的β-受體阻斷劑均相酶免疫檢測(cè)試劑，其特征在于，上述由吲 哚洛爾免疫原免疫動(dòng)物得到的抗β_受體阻斷劑特異性抗體能識(shí)別并結(jié)合各種β_受體阻 斷劑的核心結(jié)構(gòu)，所述各種β-受體阻斷劑的核心結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)式如式（II )所示：
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的β -受體阻斷劑均相酶免疫檢測(cè)試劑，其特征在于，上述指示 試劑選自酶試劑，包括：酶標(biāo)偶聯(lián)物和酶的底物；上述酶標(biāo)偶聯(lián)物包括葡萄糖-6-磷酸脫氫 酶-半抗原酶標(biāo)偶聯(lián)物；上述酶的底物為葡萄糖-6-磷酸；上述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半 抗原酶標(biāo)偶聯(lián)物由葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與吲哚洛爾衍生物偶聯(lián)形成，上述吲哚洛爾衍生 物的結(jié)構(gòu)式如式（III)所示：
上述R為-(CH2)n-COO-, η為1至20之間的整數(shù)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的β -受體阻斷劑均相酶免疫檢測(cè)試劑，其特征在于，η = 3時(shí)， 上述的吲哚洛爾衍生物的合成路線為：
6. -種β -受體阻斷劑均相酶免疫檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 權(quán)利要求4或5所述的吲哚洛爾衍生物的合成與純化，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定； (2) 吲哚洛爾免疫原的合成：使吲哚洛爾衍生物的-(CH2)n-COO-基團(tuán)與具有免疫原性 的蛋白質(zhì)載體連接，η為1至20之間的整數(shù)； (3) 用吲哚洛爾免疫原免疫動(dòng)物，制備并純化抗β-受體阻斷劑特異性抗體； (4) 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物的制備：制備葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液， 激活吲哚洛爾衍生物，使G6TOH與吲哚洛爾衍生物連接，純化連接產(chǎn)物； (5) β -受體阻斷劑均相酶免疫檢測(cè)試劑的制備： 試劑A的制備：由抗β-受體阻斷劑特異性抗體和均相酶底物混合而成； 試劑B的制備：由葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物與Tris緩沖液混合而成。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種β -受體阻斷劑均相酶免疫檢測(cè)試劑的制備方法，其特 征在于，所述的步驟（2)中，蛋白質(zhì)載體為BSA，η = 3,具體合成步驟如下： (1) 將20mg BSA溶解于5ml 0· 2Μ、pH 8. 5的PBS中，上述溶液置于燒杯A中； (2) 將如下化學(xué)品加入到燒杯B中攪拌溶解：20mg吲哚洛爾衍生物、0. 35ml二甲基甲 酰胺DMF、0. 35ml乙醇、0.7ml IOmM pH5.0的磷酸鉀緩沖液、40mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨 丙基）碳二亞胺、5mg N-羥基硫代琥珀酰亞胺，于室溫下攪拌溶解，反應(yīng)30分鐘； (3)將燒杯B中的溶液滴加至燒杯A中，得到混合溶液，在2?8°C下攪拌過夜；將上 述攪拌后的混合溶液經(jīng)過中性磷酸鹽緩沖液透析純化，得到BSA-吲哚洛爾免疫原，儲(chǔ)存 于-20。。。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種β -受體阻斷劑均相酶免疫檢測(cè)試劑的制備方法，其特 征在于，所述的步驟（4)具體過程為： (1) 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶G6PDH溶液的制備： a. 稱取15mg規(guī)格為100KU的G6PDH，室溫溶解于12mL含有72. 6mg 0· 05Μ的Tris、8mg 3. 3mM 的 MgCljP IOOmg NaCl 的溶液中，該溶液 pH = 9. 0 ; b. 加入225mg還原態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH，135mg葡萄糖-6-磷酸G-6-P以 及0. 75mL卡必醇； c. 逐滴加入2mL _甲基亞諷； (2) 吲哚洛爾衍生物的激活： a. 在無水狀態(tài)下稱取IOmg吲哚洛爾衍生物，溶解于600 μ L DMF中； b. 使上述溶液溫度降到_2?-8°C ; c. 加入3yL三丁胺； d. 加入1.5yL氯甲酸異丁酯； e. -2?-8 °C攪拌30分鐘； (3) G6H)H與吲哚洛爾衍生物的連接： a. 將上述激活的吲哚洛爾衍生物溶液逐滴加入到上述溶解的G6PDH溶液中； b. 2-8°C攪拌過夜； (4) 純化產(chǎn)物： 通過G-25凝膠層析柱純化連接產(chǎn)物，獲得的最終產(chǎn)物為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗 原偶聯(lián)物，于2-8°C下儲(chǔ)存。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種β -受體阻斷劑均相酶免疫檢測(cè)試劑的制備方法，其特 征在于，步驟（5)的具體過程如下： 試劑A的制備：將4. 036g 11. 25mM的氧化態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、1. 71 Ig 11. 25mM的葡萄糖-6-磷酸用IL 55mM、pH = 8. 0的Tris緩沖液溶解制成均相酶底物；將 制備的抗β -受體阻斷劑特異性抗體加到上述均相酶底物中，抗體與均相酶底物的體積比 為 1:100 ?1:10000 ; 試劑B的制備：將制備的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物加到120mM、pH = 8. 2 的Tris緩沖液中，上述偶聯(lián)物與Tris緩沖液的體積比為1:100?1:10000。
10. 利用權(quán)利要求1至4任意一項(xiàng)所述的β -受體阻斷劑均相酶免疫檢測(cè)試劑的檢測(cè) 方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將待測(cè)樣本與抗β -受體阻斷劑特異性抗體接觸； (2) 根據(jù)待測(cè)樣本中β -受體阻斷劑與抗β -受體阻斷劑特異性抗體的結(jié)合情況，利用 指示試劑判斷樣本中β-受體阻斷劑的含量； 所述待測(cè)樣本為尿液、血清、血漿或唾液； 上述指示試劑選自酶試劑，包括：酶標(biāo)偶聯(lián)物和酶的底物；上述酶標(biāo)偶聯(lián)物包括葡 萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標(biāo)偶聯(lián)物；上述酶的底物為葡萄糖-6-磷酸；上述葡萄 糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標(biāo)偶聯(lián)物由葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與吲哚洛爾衍生物偶聯(lián)形 成； 上述吲哚洛爾衍生物的結(jié)構(gòu)式如式（III)所示：
上述R為-(CH2)n-COO-, η為1至20之間的整數(shù)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種β-受體阻斷劑檢測(cè)試劑及其制備和檢測(cè)方法，具體涉及一種β-受體阻斷劑均相酶免疫檢測(cè)試劑及其制備和檢測(cè)方法，包括：抗β-受體阻斷劑特異性抗體、用于檢測(cè)抗β-受體阻斷劑特異性抗體-β-受體阻斷劑復(fù)合物的指示試劑；上述抗β-受體阻斷劑特異性抗體由吲哚洛爾免疫原免疫動(dòng)物得到。本發(fā)明的有益之處在于：本發(fā)明的吲哚洛爾免疫原特異性強(qiáng)、免疫原性高，制備出的抗體是能與吲哚洛爾、比索洛爾、阿替洛爾、美托洛爾和普萘洛爾等各種常用的β-受體阻斷劑特異性結(jié)合的抗β-受體阻斷劑特異性抗體，且特異性強(qiáng)、效價(jià)高，并且與常見的62種藥物無任何交叉反應(yīng)；含有上述抗β-受體阻斷劑特異性抗體的均相酶免疫檢測(cè)試劑可以方便、快速、準(zhǔn)確地確定樣品中上述各種β-受體阻斷劑的含量，并且可以在全自動(dòng)生化分析儀上同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品，實(shí)現(xiàn)β-受體阻斷劑的高通量、快速化測(cè)定，準(zhǔn)確度高，特異性強(qiáng)，精確度和檢測(cè)效率較其它方法有了較大的提高。
【IPC分類】G01N33-566
【公開號(hào)】CN104535763
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510042129
【發(fā)明人】虞留明
【申請(qǐng)人】愛斯杰科環(huán)球有限責(zé)任公司
【公開日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2015年1月27日