一種纖毛蟲的染色方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種纖毛蟲的染色方法，特別涉及一種纖毛蟲的固定及蛋白銀染色方法。
【背景技術】
[0002]纖毛蟲以纖毛作為運動的胞器，在其生命周期中至少在某一階段生有纖毛，如果不具纖毛，則仍存在表膜下的纖毛系統(tǒng)。纖毛蟲具有大核和小核兩種核型，具有兩種生殖方式，即橫二分裂的無性生殖和接合生殖的有性生殖。纖毛蟲的生活方式多樣，種類繁多。
[0003]纖毛蟲是一類十分具有研究意義的生物。纖毛蟲是海洋微食物環(huán)和經典食物鏈的重要鏈接者，在能量流動和物種循環(huán)中有重要意義；纖毛蟲是許多水產養(yǎng)殖的危害物種，有些種類爆發(fā)時會造成赤潮，而由于其周期短，對環(huán)境變化反應靈敏，又被用為生物指示種。申請?zhí)枮?00910074535.2的專利中提出，通過對纖毛蟲的研究，將纖毛蟲應用于對石油的降解中，可大大促進石油污染的治理和原油的微生物開采；申請?zhí)枮?01180022508.6的專利中，利用纖毛蟲不僅能產生scFv和Fab、還能夠產生全長的免疫球蛋白、以及纖毛蟲對病毒不易感等令人驚訝的優(yōu)勢，將纖毛蟲作為單克隆抗體、或者其片段或衍生物的表達宿主。
[0004]對纖毛蟲的研究，原始的方法是在簡單的放大鏡下進行活體觀察。由于纖毛蟲為單細胞的原生動物，其形態(tài)學研究相對于大型的多細胞動物而言由于個體小，操作不方便，無法直視等特點，需要借助多種特殊的染色技術來突出某些特殊結構的顯示，借此來區(qū)分不同的種類。
[0005]銀浸技術(Chatton & Lwoff 1930)是研究纖毛蟲形態(tài)分類特征常用的方法之一，可顯示纖毛蟲表膜下纖毛系，但該法只能顯示銀線系，而且對表膜下纖毛系的顯示效果很不理想。
[0006]蛋白銀染色方法(Shi and Frankel，1990)，是將升汞水溶液固定后進行蛋白銀染色的技術，此技術應用于原生動物，在其形態(tài)學和分類學方面的研究均取得了一定的效果。此方法可用來顯示纖毛蟲體的皮層及內部結構，如纖毛下器、毛基體、核器及各種表膜下纖維系統(tǒng)等，但銀線系統(tǒng)卻不被染色。此方法具有以下缺點:1.固定溶液采用的是飽和升汞水溶液，因溶解度影響，固定效果不佳；2.升汞飽和水溶液固定后需進行多次水洗、滴加蛋白甘油水和火棉膠等許多步驟，步驟繁瑣、耗時長；3.在固定和洗滌過程中會損失大量實驗樣本，纖毛和胞口等關鍵結構難以清晰顯示；4.在梯度酒精脫水的過程中因為染色標本的外部包有火棉膠，脫水時間長；5.此方法對技術掌握度的依賴性很強，需要操作者通過反復練習才能得到好的染色效果:若固定液水洗不徹底，會嚴重影響染色效果，若火棉膠滴加時機不當，在脫水的過程中容易讓染色成功的樣本全部隨火棉膠脫掉，導致實驗失敗。
[0007]因此，如何縮短染色時間，簡化染色步驟，提高染色效率，并且可以顯示胞口、纖毛等常規(guī)蛋白銀染色所難以顯示的結構，是目前亟待解決的問題。

【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中所存在的上述不足，提供一種纖毛蟲的固定及蛋白銀染色方法，此方法操作方便，用時少，樣本損失、損壞少，可以顯示胞口、纖毛等常規(guī)蛋白銀染色所難以顯示的結構。
[0009]為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了以下技術方案:
一種纖毛蟲的染色方法，其特征在于，纖毛蟲的固定試劑為飽和酒精升汞溶液；所述的飽和酒精升汞溶液為:無水乙醇為溶劑、氯化高汞為溶質的飽和溶液。
[0010]用飽和酒精升汞溶液代替?zhèn)鹘y(tǒng)的飽和升汞水溶液，固定效果更佳。
[0011]進一步地，纖毛蟲的染色方法中，在用飽和酒精升汞溶液對蟲體進行前固定操作之前，進行蟲體固著的操作:將待制片的纖毛蟲體置于涂有蛋清的載玻片上，并蓋上涂有二甲苯飽和石蠟溶液的蓋玻片，即完成對蟲體的固著。
[0012]進一步地，纖毛蟲的染色方法，包括以下內容:
(1)蟲體固著:將待制片的纖毛蟲體置于涂有蛋清的載玻片上，并蓋上涂有二甲苯飽和石蠟溶液的蓋玻片，得到固著有蟲體的貼片；
(2)前固定:利用飽和酒精升萊溶液對蟲體進行前固定，固定時間為l_3min；
(3)脫蓋玻片:將前固定處理后的貼片浸沒在無水乙醇中，保持帶有蓋玻片的一面朝下，使蓋玻片自然脫落；
(4)洗滌:將脫完蓋玻片的貼片放在無水乙醇中洗滌兩次，每次洗滌時間為50-70S；
(5)后固定:將貼片放入后固定液中固定30-60s;所述的后固定液為甲醒和無水乙醇等體積比混合的溶液；
(6)漂洗:將后固定的貼片用水漂洗除去多余的后固定液；
(7)氧化:將貼片放入含有氧化劑的溶液中氧化1-1.5min，然后用水漂洗除去多余的氧化劑；
(8)漂白:將氧化后的貼片放入質量濃度為5%的草酸溶液中漂白，然后用50-60°C的熱水漂洗除去多余的草酸；
(9)染色:將漂白后的貼片放入質量濃度為1%的蛋白銀溶液中，在50-55°C下水浴50_60min ；
(10)顯影:用顯影液進行顯影，在顯微鏡下顯影至蟲體的纖維結構顯現(xiàn)清晰為止；
(11)定影:將顯影后的貼片水洗后放入質量濃度為5%的硫代硫酸鈉溶液中，定影50-70s ；
(12)脫水、透明:將定影后的貼片用梯度酒精溶液進行脫水，脫水后用二甲苯進行透明；
(13)封片:將透明后的貼片用樹脂封片，即得完成纖毛蟲的染色。
[0013]本申請在飽和酒精升汞溶液固定前，就把蟲體固定在染色載玻片的固定位置，避免了傳統(tǒng)染色方法中在固定后需要多次水洗和滴加火棉膠的操作，大大縮短了實驗時間，提聞了染色效率，并提聞了染色效果。
[0014]作為優(yōu)選，步驟(6)中漂洗所用的水為蒸餾水
作為優(yōu)選，步驟(7)中所述的氧化劑是質量濃度為1%的高錳酸鉀溶液。
[0015]作為優(yōu)選，步驟(10)中所述的顯影液為:將質量濃度為0.01%的對苯二酚溶液和質量濃度為5%的無水亞硫酸鈉溶液等體積混合后形成的混合液。
[0016]作為優(yōu)選，步驟(12)中所述的梯度酒精包括以下體積分數(shù)的酒精溶液:50%、70%、80%、90%、95%、100%和100%共計7個梯度的酒精；每個梯度的酒精溶液脫水30s。
[0017]用7個濃度梯度的酒精溶液進行脫水，脫水效果更佳，保護了蟲體的完整性。
[0018]作為優(yōu)選，步驟(12)中所述的透明包括以下內容:脫水后的貼片放入二甲苯中進行兩次透明，每次透明的時間為20s。
[0019]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果如下:
1.現(xiàn)有的纖毛蟲染色過程中，固定時采用的是把所需固定的樣本在胚胎皿中用飽和的升汞水溶液固定，因溶解度影響，固定效果不佳；而本申請中采用的是飽和酒精升汞溶液(無水乙醇為溶劑、氯化高汞為溶質的飽和溶液)，可以避免上述問題，對纖毛蟲的固定效果更佳。
[0020]2.現(xiàn)有的纖毛蟲染色過程中,在用升汞飽和水溶液固定后需進行多次水洗、滴加蛋白甘油水和火棉膠等許多步驟，步驟繁瑣、耗時長；而本申請中在用飽和酒精升汞溶液進行前固定操作之前，就將待制片的蟲體固著在待染色的載玻片上，省去滴加蛋白甘油水和火棉膠等許多步驟，節(jié)約了實驗步驟，縮短了實驗時間。此外，在將蟲體固著在載玻片前，在載玻片上涂蛋清，在蓋玻片上涂二甲苯飽和石蠟溶液以形成蠟膜，這些不僅利于蟲體的固定，也與后續(xù)的其他操作步驟相適應，最大限度地保護了蟲體的完整性。
[0021]3.現(xiàn)有的纖毛蟲染色過程中，在用升汞飽和水溶液固定后需進行多次水洗的操作，加之飽和升汞水溶液的固定效果不佳，容易造成大量實驗樣本損失、纖毛蟲的纖毛和胞口等關鍵結構難以顯示；而本申請?zhí)峁┑睦w毛蟲的染色方法中，由于在前固定操作之前就將蟲體固著在載玻片上，不需要進行多次水洗的操作，并且飽和酒精升汞溶液的前固定效果好，大大減少了實驗樣本需求，并且可以顯示胞