一種橡膠樹雜交授粉稔實(shí)率的預(yù)測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，設(shè)及一種橡膠樹雜交授粉稔實(shí)率 的預(yù)測方法
【背景技術(shù)】
[0002] 橡膠樹是一種異花授粉高度雜合的木本經(jīng)濟(jì)作物，其培育周期長，授粉率和結(jié)實(shí) 率低，選育新品種效率受到很大限制，為了拓寬育種途徑，加快效率，改良品質(zhì)，人工授粉是 培育新品種的重要途徑之一。己西橡膠樹的基因高度雜合，雜種一代就有性狀分離，不同品 系間產(chǎn)量的差異很大，其中大部分是低產(chǎn)的，只有極少數(shù)較高產(chǎn)。要想把該些分散的高產(chǎn)基 因逐步集中，產(chǎn)生高產(chǎn)個(gè)體，就必須通過多次有性雜交。目前在橡膠樹領(lǐng)域所有優(yōu)良品種的 育成均是通過人工授粉手段去實(shí)現(xiàn)的。
[0003] 當(dāng)前在世界各國仍在使用并且也是唯一在使用的方法就是"雄蕊塞入法"。具體是 將父本成熟的雄蕊柱放入母本未開放的雌花中，并將雌花花被黏住，W防雨水或別的花粉 進(jìn)入。具體的雜交授粉流程為根據(jù)育種目標(biāo)，選擇授粉組合，在母樹搭設(shè)授粉架（父本有時(shí) 也要搭設(shè)授粉架W摘取雄花），授粉者登架人工授粉，1個(gè)月后檢查捻實(shí)率，3個(gè)半月后檢查 成果情況并套袋，4?5個(gè)月采摘成熟果。橡膠樹人工授粉后，其最終結(jié)果率受工人操作技 術(shù)、氣候條件、病害發(fā)生情況及母樹的營養(yǎng)條件等多方面的因素影響，因此導(dǎo)致最終的結(jié)果 率差異很大。根據(jù)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所2001?2012年歷年授粉統(tǒng)計(jì)，其結(jié)實(shí)率 從0?3. 58%不等，平均的結(jié)果率為1. 66%。但是不同組合的結(jié)果率差異非常大，如熱研 88-13X熱研217組合25000朵花（共3年）的坐果率高達(dá)5%W上，W熱研87-6-62XPR107 的組合（授粉3萬朵）也超過5% (1999?2001年），而W熱研7-33-97、熱研8-79為親本 授粉歷年累計(jì)成果率均在0. 5% W下；在云南（和麗崗，2012) 2010?2011年人工授粉工作 中，W熱呈516 X PR255的成果率最高，達(dá)到6. 41 %，W熱研8-79 X IAN873的成果率最低，僅 為0. 15%;而在廣西早期的研究中（陸永林，1991) ,1981?1983年授粉13個(gè)組合，稔實(shí)率 最高的（與結(jié)實(shí)率不同，在授粉后1個(gè)半月調(diào)查結(jié)果，而結(jié)實(shí)率W最終收獲的果實(shí)數(shù)統(tǒng)計(jì)） 為47. 9 %，最低的僅為3. 2 %，差異非常大。因此授粉時(shí)選擇結(jié)實(shí)率高的組合，能大幅提升 育種效率。由于人工授粉時(shí)前期搭設(shè)授粉架及人工授粉均系空中作業(yè)，危險(xiǎn)性較高，導(dǎo)致人 工等綜合成本非常高，根據(jù)歷年結(jié)果數(shù)與投入的總成本，測算出在海南地區(qū)獲取每個(gè)授粉 果的平均成本達(dá)到了 80?100元，甚至更高。因此，提升人工授粉的結(jié)果率也能大幅節(jié)約 授粉成本。
[0004] 傳統(tǒng)上，只有有歷史記錄統(tǒng)計(jì)的組合才知道其是否為高結(jié)實(shí)率組合，但實(shí)際上隨 著育種技術(shù)的發(fā)展，總有相當(dāng)一部分組合是新選配出來，該樣其稔實(shí)率、結(jié)實(shí)率對育種者而 言是未知的，如果貿(mào)然進(jìn)行大量授粉的話很可能會(huì)因?yàn)楹艿偷慕Y(jié)果率導(dǎo)致很大損失。
[0005] 如果進(jìn)行人工授粉的早期觀測，在什么時(shí)候取樣觀測，既能保證預(yù)測時(shí)間最早， 又能與稔實(shí)率相關(guān)性呈顯著相關(guān)，在此問題上前人已做了充分的研究。Heusse(1919 年）對橡膠樹的受精作用進(jìn)行了研究，認(rèn)為橡膠樹的受精作用發(fā)生在授粉后的3?lOd。 Majumder(1964年）否定了 Heusser的結(jié)論，他在人工授粉后一段時(shí)間切去柱頭，然后檢測 成果率，通過實(shí)驗(yàn)，他認(rèn)為受精發(fā)生在授粉后的24小時(shí)內(nèi)。我國謝石文等（1981年）研究 表明，在授粉后的2化，初生胚乳核已經(jīng)完成了一次有絲分裂，因此證明受精作用必然發(fā)生 在授粉后的24小時(shí)內(nèi)。Antoine Leconte等（1981年）運(yùn)用巧光顯微鏡和石蠟切片法觀察 到授粉后12h，花粉管就已經(jīng)進(jìn)入到胚囊，因此也說明受精作用發(fā)生在授粉后的一天之內(nèi)。 李蘭芝（1997年）采用石蠟切片，蘇木精染色等方法觀察到了橡膠花雙受精的過程，證明了 受精發(fā)生在授粉后的2化內(nèi)。采取利用授粉24h的授粉雌花進(jìn)行稔實(shí)率早期預(yù)測的方法是 非常合理的。
[0006] 總體來看，發(fā)明一種能對親本組合的稔實(shí)率、結(jié)實(shí)率進(jìn)行早期的預(yù)測方法是非常 必要和必需的，根據(jù)對組合稔實(shí)率的早期預(yù)測可W對人工授粉組合數(shù)量情況進(jìn)行有針對性 的調(diào)整，大幅減少授粉成本，并對工人授粉的效果進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，W利于指導(dǎo)授粉即時(shí)策略 的調(diào)整。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于為橡膠樹人工授粉領(lǐng)域中親本組合的稔實(shí)率早期判定提供一 種預(yù)測方法。
[000引為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明一種橡膠樹雜交授粉稔實(shí)率的預(yù)測方法，包括樣 品固定、沖洗樣品、樣品軟化透明、樣品再?zèng)_洗、樣品染色與壓片、觀察樣品。具體步驟如 下：
[0009] 1)樣品固定：用綴子將2化前橡膠樹雜交授粉的雌花從花柄處輕輕摘下，快速放 入裝有配置好的福爾馬林-冰醋酸-酒精的固定液離屯、管中，返回實(shí)驗(yàn)室后，盡快將固定液 內(nèi)雌花的花被用綴子剝下，W便柱頭上花粉能充分得到固定。
[0010] 所述的樣品固定用配置好的福爾馬林-冰醋酸-酒精的固定液，固定液的福爾馬 林-冰醋酸-酒精的比例為38%福爾馬林：冰醋酸：50%酒精=1 : 1 : 18。
[0011] 2)沖洗樣品；樣品固定化后，將離屯、管中的固定液倒出，用蒸饋水沖洗樣品0.化， 充分洗凈固定液。
[0012] 3)樣品軟化透明：在沖洗干凈的樣品中加入8mol/L化0H溶液4?6ml，放在設(shè)置 為55°C的水浴鍋中加熱化，使樣品軟化透明。
[001引 4)樣品再?zèng)_洗；將離屯、管從水浴鍋中取出，倒出化0H溶液，用蒸饋水沖洗樣品化， 放置5min后，直至樣品周圍蒸饋水的顏色不再變黃為止。
[0014] 5)樣品染色與壓片；用綴子將已沖洗干凈的樣品輕輕取出，放在平面載玻片上， 用吸水紙將樣品周圍的蒸饋水吸干。用滴管滴1?2滴苯胺藍(lán)染液于樣品上，蓋上蓋玻片， 用綴子輕輕壓蓋玻片，將柱頭壓扁，染液充分進(jìn)入柱頭，W便于觀察。
[0015] 6)觀察樣品：應(yīng)用巧光顯微鏡，使用藍(lán)紫光濾光片，將壓好的玻片放在巧光顯微 鏡下觀察，拍照并記錄柱頭上的花粉個(gè)數(shù)及花粉管萌發(fā)距離的情況。如果每個(gè)柱頭上3個(gè) 裂片上均有1個(gè)W上花粉粒萌發(fā)出花粉管，在合適環(huán)境條件下該柱頭將會(huì)稔實(shí)、結(jié)果。當(dāng)天 取樣結(jié)果將能準(zhǔn)確預(yù)測前一天的人工授粉稔實(shí)率。
[0016] 本發(fā)明一種橡膠樹雜交授粉稔實(shí)率的預(yù)測方法通過采用對落入母本雌花柱頭裂 片花粉及其萌發(fā)情況來判斷授粉的效果，解決了對雜交組合授粉稔實(shí)率的早期預(yù)測問題。 該方法預(yù)測橡膠樹雜交授粉的稔實(shí)率，將預(yù)測時(shí)間由1個(gè)多月縮短至2d之內(nèi)?；谠擃A(yù) 測結(jié)果可W及時(shí)對人工授粉組合數(shù)量情況進(jìn)行有針對性的調(diào)整，并對工人授粉的效果進(jìn)行 實(shí)時(shí)監(jiān)測，W對授粉的親本選配、授粉策略作出準(zhǔn)確和及時(shí)的調(diào)整，能大幅節(jié)約人工授粉成 本，擴(kuò)大授粉子代群體，將為橡膠樹相關(guān)遺傳研究及品種選育提供寶貴的試驗(yàn)材料。
【具體實(shí)施方式】
[0017] W下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[001引本發(fā)明一種橡膠樹雜交授粉稔實(shí)率的預(yù)測方法實(shí)施時(shí)，步驟如下；
[0019] 1)樣品固定；先在實(shí)驗(yàn)室將配置好的福爾馬林-醋酸-酒精固定液（FAA，福爾馬 林（38%甲醒）；醋酸（冰醋酸）；酒精（50%酒精）=1;1:18)，分裝在6個(gè)10ml離屯、管 中，每個(gè)離屯、管中6ml固定液，并在離屯、管外貼上空白標(biāo)簽，W便記錄雜交組合的品種。將 離屯、管放在試管架上，帶到大田取樣。取樣時(shí)，可用熱研87-6-62X熱研88-13、IAN873X 熱呈 501、熱研 88-13 X 熱研 87-6-62、IAN873X 熱研 88-13、文昌 217 X 熱研 87-6-62、熱 研88-13 X IAN873等6個(gè)組合，選取有記錄的授粉花，每個(gè)組合按不同朝向隨機(jī)摘取30個(gè) 樣，用綴子將前一天進(jìn)行授粉的雌花輕輕摘下，快速放入離屯、管中的固定液內(nèi)，并在離屯、管 外的標(biāo)簽上寫下此雜交組合的父本和母本?；氐綄?shí)驗(yàn)室，立即將固定液內(nèi)雌花的花被用綴 子剝下，W便柱頭上花粉能充分得到固定。
[0020] 2)沖洗樣品：樣品固定2小時(shí)后，將離屯、管中的固定液倒出，用蒸饋水沖洗樣品 0. 5h，充分洗凈固定液。
[0021] 3)樣品軟化透明：在沖洗干凈的樣品中加入8mol/L化OH溶液5ml，放在設(shè)置為 55°C的水浴鍋中加熱化，使樣品軟化透明。
[002引 4)樣品再?zèng)_洗；將離屯、管從水浴鍋中取出，倒出化OH溶液，用蒸饋水沖洗樣品化， 放置5min后，直至樣品周圍蒸饋水的顏色不再變黃為止。
[0023] 5)樣品染色與壓片：用綴子將已沖洗干凈的樣品輕輕取出（此時(shí)的樣品經(jīng)過了軟 化和透明，非常軟，易被破壞），放在載玻片上，用吸水紙將樣品周圍的蒸饋水吸干。用滴管 滴1?2滴苯胺藍(lán)染液于樣品上，蓋上蓋玻片，用綴子輕輕壓蓋玻片，將柱頭壓扁，染液充分 進(jìn)入柱頭，W便于觀察。
[0024] 6)觀察樣品；應(yīng)用妹卡巧光顯微鏡（Leica-DMLB)，使用藍(lán)紫光濾光片（藍(lán)光），將 壓好的玻片放在巧光顯微鏡下觀察，拍照并記錄柱頭3個(gè)裂片各自的花粉個(gè)數(shù)及花粉管萌 發(fā)的情況。觀察結(jié)果表明，6個(gè)組合中，授粉成功率W熱研88-13 X IAN873組合最高，達(dá)到了 35. 6%，W熱研88-13X熱研87-6-62和文昌217X熱研87-6-62組合最低，只有2. 2%，其 他組合的成功率介于二者之間，整體上可W看出不同組合的親本配合力差異很大，因此為 了達(dá)到好的授粉效果，獲取更多授粉果，提前對雜交組合授粉稔實(shí)率進(jìn)行預(yù)測是非常必要 的。具體結(jié)果如下表1 ;
[0025] 表1不同人工授粉組合雌花鏡檢及大田調(diào)查結(jié)果
[0026]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種橡膠樹雜交授粉稔實(shí)率的預(yù)測方法，其特征在于將橡膠樹雜交授粉的雌花放入 福爾馬林-冰醋酸-酒精的固定液中讓柱頭上的花粉得到固定，樣品固定后用蒸餾水沖洗， 然后在樣品中加入NaOH溶液使樣品軟化透明，再用蒸餾水沖洗樣品，放在平面載玻片上滴 1?2滴苯胺藍(lán)染液于樣品，蓋上蓋玻片，用熒光顯微鏡觀察和拍照并記錄柱頭上的花粉個(gè) 數(shù)及花粉管萌發(fā)距離的情況。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種橡膠樹雜交授粉稔實(shí)率的預(yù)測方法，其特征在于所 述的固定液的福爾馬林-冰醋酸-酒精的比例為38%福爾馬林：冰醋酸：50%酒精= I ： 1 ： 18〇
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種橡膠樹雜交授粉稔實(shí)率的預(yù)測方法，其特征在于所述的 樣品軟化透明是在沖洗干凈的樣品中加入8mol/L NaOH溶液4?6ml，放在設(shè)置為55°C的 水浴鍋中加熱2h，使樣品軟化透明。
【專利摘要】本發(fā)明一種橡膠樹雜交授粉稔實(shí)率的預(yù)測方法，包括樣品固定、沖洗樣品、樣品軟化透明、樣品再?zèng)_洗、樣品染色與壓片、鏡檢觀察樣品。本發(fā)明通過采用對落入母本雌花柱頭裂片花粉及其萌發(fā)情況來判斷授粉的效果，解決了對雜交組合授粉稔實(shí)率的早期預(yù)測問題。該方法預(yù)測橡膠樹雜交授粉的稔實(shí)率，將預(yù)測時(shí)間由1個(gè)半月縮短至2d之內(nèi)。依據(jù)該預(yù)測結(jié)果可以對工人授粉的效果進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，以及時(shí)對人工授粉組合授粉數(shù)量情況進(jìn)行有針對性的調(diào)整，并對授粉的親本選配、授粉策略作出及時(shí)而準(zhǔn)確的調(diào)整，能大幅節(jié)約人工授粉成本。
【IPC分類】G01N1-30, G01N1-28, G01N21-64
【公開號】CN104568869
【申請?zhí)枴緾N201410765547
【發(fā)明人】高新生, 李維國, 王祥軍, 張曉飛, 黃肖
【申請人】中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月12日