用于檢測(cè)牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的方法及檢測(cè)試紙的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種用于檢測(cè)牛奶中目-內(nèi)醜胺酶的方法 及試紙條。 技術(shù)背景
[0002] 目-內(nèi)醜胺酶（目-lactamase)是常見的市售解抗劑中的主要成分，它由革蘭氏陽(yáng) 性細(xì)菌產(chǎn)生和分泌，可選擇性地分解用于牛奶中的目-內(nèi)醜胺類抗生素，是我國(guó)不允許使 用的食品添加劑。
[0003] 為了防止奶畜養(yǎng)殖的過(guò)程中乳房炎等常見疾病，目-內(nèi)醜胺類抗生素是被經(jīng)常使 用的抗生素藥物之一。而國(guó)家規(guī)定在生鮮乳收購(gòu)環(huán)節(jié)中需要檢測(cè)抗生素，并要求不得超過(guò) 最高殘留限量。如果超標(biāo)，按規(guī)定乳品企業(yè)不允許收購(gòu)該些生乳。在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，市 場(chǎng)上開始出現(xiàn)人為添加目-內(nèi)醜胺酶來(lái)分解抗生素、從而使抗生素超標(biāo)奶變?yōu)楹细癞a(chǎn)品的 違法情況。
[0004] 目-內(nèi)醜胺酶的違規(guī)使用不利于政府和乳品企業(yè)監(jiān)管目-內(nèi)醜胺類抗生素的濫 用，而抗生素的濫用會(huì)造成人體產(chǎn)生藥物耐藥性等多種不良后果，所W必須禁用目-內(nèi)醜 胺酶。
[0005] 2009年我國(guó)在少數(shù)乳制品中檢查出含有目-內(nèi)醜胺酶。當(dāng)年，國(guó)家衛(wèi)生部等九部 口組成了專項(xiàng)小組，為配合全國(guó)打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專項(xiàng)整治工作 的深入開展，將目-內(nèi)醜胺酶列入《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單》，并展開了全 國(guó)范圍內(nèi)的監(jiān)管。
[0006] 目前國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)方法由衛(wèi)生部及有關(guān)科研院所提出，包括杯碟法、液相色 譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法、楓量法H種檢驗(yàn)方法。但是該些方法均有操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)和檢測(cè)成本 高的特點(diǎn)，所W市場(chǎng)上也陸續(xù)開始出現(xiàn)適合企業(yè)現(xiàn)場(chǎng)快速篩選的方法和產(chǎn)品。而快檢產(chǎn)品 中，進(jìn)口產(chǎn)品占據(jù)了絕大多數(shù)的市場(chǎng)份額。該些進(jìn)口快檢產(chǎn)品價(jià)格昂貴，檢測(cè)限一般為4U/ mU檢測(cè)結(jié)果判斷不直觀，且整個(gè)檢測(cè)過(guò)程時(shí)間較長(zhǎng)，極大地增加了企業(yè)和政府部口等客戶 的經(jīng)濟(jì)成本。
[0007] 為了維護(hù)廣大消費(fèi)者的身體健康、盡可能地節(jié)省國(guó)家政府部口和乳品企業(yè)的檢測(cè) 成本，市場(chǎng)急需一種靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、用時(shí)短、更加經(jīng)濟(jì)有效的e-內(nèi)醜胺酶檢測(cè)方法 及其相應(yīng)產(chǎn)品的出現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明目的是提供一種靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、用時(shí)短、更加經(jīng)濟(jì)有效的用于檢測(cè)牛 奶中目-內(nèi)醜胺酶的方法及檢測(cè)試紙。
[0009] 為達(dá)上述目的，提供了如下的技術(shù)方案：
[0010] 一種用于檢測(cè)牛奶中目-內(nèi)醜胺酶的方法，利用目-內(nèi)醜胺酶反應(yīng)底物與牛奶中 存在的目-內(nèi)醜胺酶反應(yīng)，產(chǎn)生青霉喔哇酸；所述青霉喔哇酸取代青霉喔哇酸-BSA，與膠體 金上包被的抗青霉喔哇酸單克隆抗體結(jié)合。
[0011] 作為一個(gè)優(yōu)選的方案，檢測(cè)步驟為：
[0012] (1)、所述目-內(nèi)醜胺酶反應(yīng)底物與牛奶反應(yīng)，形成反應(yīng)液；
[0013] (2)、將所述反應(yīng)液與所述膠體金中包被有的所述抗青霉喔哇酸單克隆抗體進(jìn)行 反應(yīng)；
[0014] (3)、反應(yīng)后，加入所述青霉喔哇酸-BSA，觀察反應(yīng)結(jié)果。
[0015] 作為進(jìn)一步的優(yōu)選的方案，所述檢測(cè)步驟皆采用水浴加熱。
[0016] 作為另一個(gè)優(yōu)選的方案，所述膠體金為凍干的膠體金。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種目-內(nèi)醜胺酶檢測(cè)試紙，包括；樣品墊、硝酸纖維膜、吸水墊 和支撐膠板，所述硝酸纖維膜上有檢測(cè)線和質(zhì)控線；所述檢測(cè)線包被青霉喔哇酸-BSA，所 述質(zhì)控線包被羊抗鼠IgG。
[0018] 作為進(jìn)一步的優(yōu)選的方案，所述青霉喔哇酸-BSA的濃度是0. 05?Img/mL。
[0019] 作為另一個(gè)進(jìn)一步的優(yōu)選的方案，所述羊抗鼠IgG的濃度是0. 1?5mg/mL。
[0020] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的檢測(cè)方法與檢測(cè)試紙的優(yōu)點(diǎn)為：
[002。 1.靈敏度高，可W檢測(cè)牛奶中大于等于4U/mL的目-內(nèi)醜胺酶，適用于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中 規(guī)定的檢測(cè)上限標(biāo)準(zhǔn)，與目前市場(chǎng)上占主要份額的進(jìn)口產(chǎn)品靈敏度一致，甚至更高。
[0022] 2.檢測(cè)方法與檢測(cè)試紙的操作步驟都十分簡(jiǎn)單，很大程度上縮短了檢測(cè)用時(shí)。
[002引 3.檢測(cè)試紙采用消線法判斷結(jié)果，與采用比色法判斷結(jié)果相比更直觀，不易產(chǎn)生 混淆。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1為本發(fā)明的檢測(cè)原理示意圖；
[00巧]圖2為本發(fā)明試紙條結(jié)構(gòu)示意圖；
[0026] 圖3為本發(fā)明檢測(cè)方法的操作過(guò)程流程圖；
[0027] 圖4為本發(fā)明的檢測(cè)試紙結(jié)果判定為陰性的示意圖；
[0028] 圖5為本發(fā)明的檢測(cè)試紙結(jié)果判定為陽(yáng)性的示意圖；
[0029] 圖6為本發(fā)明的檢測(cè)試紙結(jié)果無(wú)效的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 為使本發(fā)明的技術(shù)手段、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】， 進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0031] 1.青霉喔哇酸與載體蛋白的偶聯(lián)
[0032] 采用邸C-N服法將青霉喔哇酸與載體蛋白（牛血清白蛋白BSA或卵清蛋白OVA) 偶聯(lián)，制備免疫抗原與包被抗原。稱取lOOmg青霉素G，用2血的0. 02M的抑7. 0的PBS完 全溶解，冰浴下滴加1血含有51mg EDC與25. 2mg N服的0. 02M的抑為7. 0的PBS溶液， 繼續(xù)冰浴避光攬拌2小時(shí)。后滴加20 y L的目-琉基己醇終止反應(yīng)。
[003引將此青霉喔哇酸活潑醋衍生中間產(chǎn)物逐滴加入2血含25mg/mLBSA的0. 02M的 pH7. 0的PBS溶液中，4°C避光攬拌24小時(shí)。
[0034] 24小時(shí)后將反應(yīng)物取出，1(TC離也去沉淀，上清于4°C用0. 02M的抑7. 0的PBS透 析3天后凍干保存，作為免疫抗原待用。
[00巧]采用同樣的方法用OVA制備青霉喔哇酸-OVA加合物作為包被抗原。
[0036] 2.抗青霉喔哇酸單克隆抗體的制備
[0037] 取6?8周齡雌性Ba化/c小鼠，將作為免疫抗原的青霉喔哇酸-BSA偶聯(lián)物與等 體積的弗氏完全佐劑乳化，按50ug/只劑量皮下注射，之后每隔3周加強(qiáng)免疫1次，用弗氏 不完全佐劑腹腔注射。融合前3d強(qiáng)化免疫1次，不用佐劑，劑量加倍。細(xì)胞融合按常規(guī)方 法進(jìn)行：將Sp2/0多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞按1 ; 10的比例混合，在50%聚己二醇作 用下融合，HAT培液息浮，分種于96孔培養(yǎng)板中，37C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0038] 融合后，待細(xì)胞生長(zhǎng)到培養(yǎng)孔面積的1/4時(shí)，采用分步篩選法篩選雜交瘤細(xì)胞。初 篩選擇lOmg/L青霉喔哇酸-BSA包被酶標(biāo)板，被測(cè)孔加培養(yǎng)上清，賠育、清洗后，加入酶標(biāo)羊 抗鼠IgG-HRP (1:1000)，0PD顯色。篩選出的陽(yáng)性孔再用青霉喔哇酸-OVA偶聯(lián)物包被的 酶標(biāo)板進(jìn)行阻斷間接化ISA。將細(xì)胞培養(yǎng)上清與2 X l(T3mol/L青霉喔哇酸溶液等量混合， 37°C賠育比，加入已包被的酶標(biāo)板中。另外用PBS (0. Olmol/L、抑7. 4)替代青霉喔哇酸溶 液作為對(duì)照，其余步驟同上。若青霉喔哇酸阻斷后的0D值降至對(duì)照孔的50% W下，則判為 陽(yáng)性孔。經(jīng)2?3次檢測(cè)都呈陽(yáng)性的孔，立即用有限稀釋法進(jìn)行克隆化。
[0039] 體外培養(yǎng)；將克隆化的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞濃度達(dá)5 X l〇5/mL時(shí)停止換液，收集 細(xì)胞。體內(nèi)誘生腹水；給腹腔注射液體石蠟10天后的小鼠腹腔注射克隆化細(xì)胞株1〇7個(gè)細(xì) 胞，7天后抽取腹水。
[0040] 將腹水與0. 05M PBS (抑7. 4)溶液等體積混合，緩慢攬拌下滴加腹水和PBS總體 積X 0. 818血的飽和硫酸饋，室溫?cái)埌?0min ; 1000化pm離也lOmin，