Pda修飾的紙基微流控芯片及其在dna比色檢測(cè)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種聚二乙炔(PDA)修飾的紙基微流控芯片及其在雙鏈DNA(dsDNA)比色檢測(cè)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，紙基DNA檢測(cè)的方法有以下幾種:電化學(xué)法、電致化學(xué)發(fā)光法、熒光分析法、比色分析法等。相比于其它檢測(cè)方法，比色分析法操作簡(jiǎn)單、噪聲低、無(wú)需使用昂貴的儀器設(shè)備，這對(duì)發(fā)展中國(guó)家或地區(qū)來(lái)說(shuō)是一種可以被大眾接受的檢測(cè)方法。
[0003]2007年，Whitesides小組首次提出紙基微流控概念。近年來(lái)，紙基微流控技術(shù)已經(jīng)得到非常迅速的發(fā)展。與傳統(tǒng)的硅、玻璃、聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片相比較，紙基微流控芯片具有成本低、分析系統(tǒng)微型化、便于攜帶、生物兼容性好、后處理簡(jiǎn)單無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)。到目前為止，一些加工方法已用于紙基微流控芯片制作，比如剪紙法、照相平板加工法、噴墨印刷法、等離子處理法、蠟轉(zhuǎn)染法等。相比于這些加工方法，蠟網(wǎng)印加工方法的優(yōu)勢(shì)在于:制作容易、成本低、且所需設(shè)備簡(jiǎn)單，無(wú)需高技術(shù)人才。
[0004]PDA是一類(lèi)新型的環(huán)境響應(yīng)共軛聚合物，它是由紫外線或者伽瑪射線輻照形成的藍(lán)色聚合物。聚合反應(yīng)過(guò)程不需要其他任何催化劑或者引發(fā)劑，因此所形成的PDA產(chǎn)物沒(méi)有任何其他雜質(zhì)，無(wú)需后處理，從而極大地方便了后期DNA檢測(cè)。PDA是一種基于分子自組裝的生物識(shí)別器件，與傳統(tǒng)的親和層析、印跡法、凝膠電泳檢測(cè)核酸相比，無(wú)需加入熒光和放射性標(biāo)記物質(zhì)、無(wú)需添加任何酶、更安全、且長(zhǎng)期保存而不失生物活性。此外，PDA具有生物兼容性好、響應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)，因而受到了廣泛的關(guān)注。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的首要目的在于提供一種PDA修飾的紙基微流控芯片的制備方法，該方法首次將PDA與紙基微流控芯片結(jié)合起來(lái)，利用了紙的非特異性吸附性質(zhì)，并結(jié)合PDA的傳感特性來(lái)檢測(cè)dsDNA，從而制成一種基于PDA的紙基微流控芯片比色傳感器。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供由上述方法制得的紙基微流控芯片，該芯片操作簡(jiǎn)單、便于攜帶。
[0007]本發(fā)明的再一目的在于提供上述的紙基微流控芯片在dsDNA比色檢測(cè)中的應(yīng)用，該技術(shù)巧妙地結(jié)合了 PDA光感材料和紙基微流控技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，無(wú)需任何復(fù)雜設(shè)備、操作簡(jiǎn)單、實(shí)用性強(qiáng)。
[0008]本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0009]一種PDA修飾的紙基微流控芯片的制備方法，包括以下步驟:
[0010](I)紙基微流控芯片加工
[0011]將網(wǎng)板緊貼在層析紙上方，然后在網(wǎng)板上涂蠟，蠟透過(guò)網(wǎng)板滲透在紙上；然后，將附著層析紙的網(wǎng)板置于加熱板上加熱，層析紙與加熱板直接接觸；加熱后，層析紙與網(wǎng)板分離，室溫冷卻晾干，得到微陣列紙基微流控芯片；網(wǎng)板通過(guò)加熱擦拭去除多余的蠟，從而可反復(fù)使用；
[0012]所述的層析紙是Whatman I號(hào)層析紙(20mmX20mm)，網(wǎng)印時(shí)層析紙被分成三等份，每份紙的大小約為6.7mmX 20mm ；
[0013]所述的網(wǎng)板優(yōu)選為300目網(wǎng)紗網(wǎng)板；
[0014]所述的將網(wǎng)板置于加熱板上加熱，優(yōu)選溫度85°C加熱5s ；
[0015]所述網(wǎng)板的圖案由Adobe Illustrate CS5軟件設(shè)計(jì)，該網(wǎng)板擬在紙上網(wǎng)印出親水區(qū)的陣列圓直徑優(yōu)選為8_;
[0016](2)帶伯胺基團(tuán)的PDA衍生物制備
[0017]2.1制備PCDA-NHS:將10，12- 二十五二炔酸(PCDA)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)溶于二氯甲烷溶液中，在室溫、避光密封、磁力攪拌的條件下反應(yīng)3h ;旋蒸去除有機(jī)溶劑；將旋蒸后的固體用乙酸乙酯、水萃取三次，利用Na2SO4粉末除去殘留水分，旋蒸得到白色固體PCDA-NHS ；
[0018]2.2制備PCDA-EDEA:將所得的PCDA-NHS溶于二氯甲烷中；然后將PCDA-NHS溶液加入到2，2’-(乙烯二氧)雙(乙胺)(EDEA)中，邊加入邊攪拌以加速反應(yīng)，在室溫、避光密封、磁力攪拌的條件下反應(yīng)5h ;旋蒸去除有機(jī)溶劑；將旋蒸后的固體用乙酸乙酯、水萃取三次，利用Na2SO4粉末除去殘留水分，接著旋蒸去除乙酸乙酯；將得到的白色固體通過(guò)硅膠柱層析，旋蒸得到純PCDA-EDEA ；
[0019]2.3PCDA與PCDA-EDEA自組裝形成PDA:將PCDA與上述得到的PCDA-EDEA溶解于二氯甲烷中，用N2流吹干溶液得到白色固體；將白色固體溶于2-嗎啉乙磺酸(MES)緩沖液中，在80°C下超聲處理20min，經(jīng)0.5 μ L注射式過(guò)濾器過(guò)濾得到溶液；溶液置于4°C冰箱中過(guò)夜處理，得到PDA(避光、密封保存)；
[0020](3)紙基微流控芯片的PDA修飾
[0021]用pH值5.5的MES緩沖液潤(rùn)濕紙基微流控芯片的反應(yīng)池，然后用氮?dú)獯蹈煞磻?yīng)池；取上述的PDA溶液滴加到反應(yīng)池中，待溶液均勻充滿整個(gè)反應(yīng)池，避光晾干，或者用N2吹干；使用前，將芯片在紫外光下照射數(shù)秒，使芯片上修飾的PDA聚合，得到TOA修飾的紙基微流控芯片；不立即使用時(shí)將該芯片避光、密封保存，以儲(chǔ)備待用。
[0022]上述方法制得的PDA修飾的紙基微流控芯片可用于dsDNA比色檢測(cè)，具體包括以下步驟:
[0023]將待測(cè)dsDNA樣品加入到紫外聚合過(guò)的反應(yīng)池中，室溫條件下進(jìn)行比色反應(yīng)數(shù)分鐘；采用智能手機(jī)來(lái)采集反應(yīng)池顏色變化，得到JPG格式圖片；獲得的圖片通過(guò)Photoshop軟件的RGB通道來(lái)分析，從而得到紙基反應(yīng)池中PDA對(duì)待測(cè)DNA的比色響應(yīng)值；比色響應(yīng)值越大，表示樣品中dsDNA的濃度越大；
[0024]比色響應(yīng)值(colorimetric response，CR)通過(guò)以下式子計(jì)算:
[0025]CR(% ) = [(PB0-PBf)/PB0] X 100
[0026]其中，PB。表示未加入dsDNA時(shí)藍(lán)色聚二乙炔的RGB藍(lán)色通道顏色強(qiáng)度占RGB紅藍(lán)通道顏色強(qiáng)度的百分比#8{表示加入dsDNA反應(yīng)后紅色聚二乙炔的RGB藍(lán)色通道顏色強(qiáng)度占RGB紅藍(lán)通道顏色強(qiáng)度的百分比；
[0027]PB = Ablue/ (Ablue+Ared)，Ablue表示聚二乙炔對(duì)RGB藍(lán)色通道的顏色強(qiáng)度，A 表示聚二乙炔對(duì)RGB紅色通道的顏色強(qiáng)度。
[0028]本發(fā)明方法的基本原理是:利用層析紙纖維素非特異性吸附固定PDA脂質(zhì)體。PDA作為光感材料，在紫外光照射下，有序排列的帶伯胺基團(tuán)的PCDA衍生物(PCDA-EDEA)與PCDA分子發(fā)生聚合反應(yīng)，通過(guò)1，4加成反應(yīng)生成聚二乙炔，其骨架自發(fā)地發(fā)生扭曲，呈現(xiàn)藍(lán)色。當(dāng)待檢dsDNA滴加到帶伯胺基團(tuán)的PDA修飾的紙基微流控反應(yīng)池中時(shí)，PDA迅速發(fā)生質(zhì)子化，形成的PDA衍生物帶正電荷，它與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的磷酸基團(tuán)負(fù)電荷發(fā)生離子反應(yīng)。該反應(yīng)影響到聚合物骨架構(gòu)象，從而使聚二乙炔顏色由藍(lán)色變?yōu)榧t色。
[0029]此方法可以提供快速的、視覺(jué)上的半定量dsDNA檢測(cè)。更重要的是，該方法根據(jù)聚乙二炔由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色的程度，可以實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。
[0030]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
[0031](I)相比于傳統(tǒng)的DNA定量檢測(cè)，本發(fā)明PDA修飾的紙基微流控芯片比色檢測(cè)方法無(wú)需加入熒光或放射性標(biāo)記物、無(wú)需添加任何酶，因此比色檢測(cè)芯片在操作上更安全，且可以長(zhǎng)期保存而不失生物活性。
[0032](2)本發(fā)明方法充分利用紙纖維素的非特異性吸附作用來(lái)固定PDA光感材料。因此，相比于以玻璃材質(zhì)為基礎(chǔ)的基因比色檢測(cè)法，本發(fā)明的方法無(wú)需對(duì)芯片進(jìn)行氧化修飾等預(yù)處理，從而避免了帶伯胺功能基團(tuán)的PDA與玻片氧化產(chǎn)生的醛基鍵合反應(yīng)不完全所帶來(lái)的不利影響。
[0033](3)相比于其它方法的芯片制備過(guò)程，本發(fā)明方法在PDA修飾的芯片制備過(guò)程中不涉及到任何沖洗過(guò)程，從而完全避免了由反復(fù)沖洗所帶來(lái)的后續(xù)檢測(cè)的不利影響。
[0034](4)相比于液相PDA比色檢測(cè)dsDNA方法，本發(fā)明方法極大地提高了檢測(cè)靈敏度，檢測(cè)限低達(dá)ΙΟηΜ，提高了 I個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0035](5)相比于液相PDA比色檢測(cè)dsDNA方法，本發(fā)明方法極大地提高了檢測(cè)速度，約5min可完成檢測(cè)。
[0036](6)相比于其它昂貴且復(fù)雜的檢測(cè)系統(tǒng)，本發(fā)明的比色檢測(cè)方法只需要簡(jiǎn)單、廉價(jià)的智能手機(jī)。利用Photoshop軟件對(duì)所獲圖像進(jìn)行分析處理，極大地節(jié)省了檢測(cè)成本。
【附圖說(shuō)明】
[0037]圖1是PDA修飾的紙基微流控芯片制作過(guò)程及該芯片用于DNA比色檢測(cè)的示意圖。
[0038]圖2是本發(fā)明的紙基微流控芯片的實(shí)物圖。
[0039]圖3是紙基芯片反應(yīng)池中PDA對(duì)不同濃度dsDNA的比色響應(yīng)成像圖。
[0040]圖4是本發(fā)明方法中待檢dsDNA濃度與比色響應(yīng)值之間的關(guān)系圖。
[0041]圖5是本發(fā)明中待檢dsDNA的PDA比色響應(yīng)值隨反應(yīng)時(shí)間變化的成像圖。
[0042]圖6是本發(fā)明中待檢dsDNA的PDA比色響應(yīng)值與反應(yīng)時(shí)間之間的關(guān)系圖。
【具體實(shí)施方式】
[0043]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0044]實(shí)施例1
[0045]一種PDA修飾的紙基微流控芯片，由以下步驟制備得到:
[0046](I)紙基微流控芯片加工
[0047]采用Adobe Illustrate CS5軟件設(shè)計(jì)網(wǎng)板圖案，根據(jù)該圖案