一種隱性孔雀石綠半抗原的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及免疫化學技術(shù)領(lǐng)域，具體地，設(shè)及一種隱性孔雀石綠半抗原的制備方 法。
【背景技術(shù)】
[000引孔雀石綠（Malachite Green,MG)是綠色有金屬光澤的晶體，極易溶于水形成藍綠 色溶液，可溶于甲醇、己醇或戊醇。MG是一種既可W用作絲銅、皮革和紙張的染料，也可W 作生物染色劑的合成的=苯甲燒類化學物，它同時也是殺菌劑，曾廣泛用于預(yù)防和治療各 類水產(chǎn)動物的觸霉病、水霉病W及小瓜蟲病等。我國于2002年5月將孔雀石綠列入《食品 動物禁用的獸藥及其化合物清單》中，于2005年制定了孔雀石綠的使用標準，規(guī)定在水產(chǎn)品 中，MG的檢出率不得超過1 y g/kg，但違規(guī)使用孔雀石綠的事件時有發(fā)生。
[0003] 目前，對于孔雀石綠和隱性孔雀石綠的殘留檢測主要方法是采用氣相色譜或者液 相色譜及其連用技術(shù)，W上方法雖然可W精確定量，但必需體積龐大而又昂貴的儀器設(shè)備， 且成本高、周期長，不適用于現(xiàn)場快速檢測。免疫分析檢測技術(shù)是近年來在環(huán)境及食品檢測 等領(lǐng)域開發(fā)出的一種新型的快速準確檢測方法，美國化學協(xié)會已將免疫分析方法與氣相色 譜和液相色譜并列為化學獸藥殘留分析的=大支柱技術(shù)，該也為孔雀石綠及隱性孔雀石綠 的殘留檢測提供了 一種新的檢測途徑。
[0004] 孔雀石綠和無色孔雀石綠是小分子物質(zhì)，沒有免疫原性，必須與載體蛋白偶聯(lián)后 才可制備免疫抗原。在合成化學允許的前提下，免疫半抗原設(shè)計的基本原則是；免疫半抗原 與載體連接后再結(jié)合抗原中能最大程度保持和突出待測物的特征結(jié)構(gòu)，特別是立體結(jié)構(gòu)。 所W，免疫半抗原主要由下列結(jié)構(gòu)部分組成；待測物特征結(jié)構(gòu)，用于連接特征結(jié)構(gòu)和載體的 間隔分子（間隔臂）和末端的活性基團。而孔雀石綠或隱性孔雀石綠分子本身沒有可與載 體蛋白結(jié)合的可供活化的功能基團，因此無法直接制備人工抗原，需要先通過化學方法設(shè) 計出其半抗原，再進一步與載體蛋白結(jié)合獲得具有免疫性的完全抗原。隱性孔雀石綠半抗 原合成的關(guān)鍵步驟是活性手臂的延長，現(xiàn)有的合成方法中多采用借助N，0或者雙鍵等方式 延長活性手臂，該方法的缺陷在于引入了雜原子或其它極性基團，而理論上，間隔臂一般應(yīng) 為非極性，除供偶聯(lián)的活性基團外，不應(yīng)該含有其它高免疫活性的結(jié)構(gòu)，如苯環(huán)，雜原子，哲 基等，W降低抗體對間隔臂的識別和間隔臂對待測特征結(jié)構(gòu)的影響?，F(xiàn)在已報道的間隔臂 為飽和碳鏈的隱性孔雀石綠半抗原的合成步驟繁瑣，終產(chǎn)率較低。本方法提供了一種反應(yīng) 條件溫和，有機溶劑使用量少，副產(chǎn)物少，操作步驟簡單，且間隔臂為飽和鏈姪的隱性孔雀 石綠半抗原的制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，提供一種條件溫和，有機溶 劑使用量少，副產(chǎn)物少，操作步驟簡單的隱性孔雀石綠半抗原的制備方法。
[0006] 為達到W上目的，本發(fā)明提供了一種隱性孔雀石綠半抗原的制備方法，包括W下 步驟：
[0007] 步驟一：將4-漠苯甲醒或4-艦苯甲醒與丙締醒縮二己醇或通式（I )所示的化 合物在存在Heck反應(yīng)配體、醋酸鈕和縛酸劑的條件下進行Heck反應(yīng)獲得化合物1 ;
[000引步驟二：將化合物1與N，N-二甲基苯胺進行縮合反應(yīng)獲得化合物2 ;
[0009] 步驟S ;將化合物2溶解于1，4-二氧六環(huán)中，加飽和氨氧化鋼溶液至抑值為 9-10,反應(yīng)獲得通式（II )所示的隱性孔雀石綠半抗原；
[0010]
【主權(quán)項】
1. 一種隱性孔雀石綠半抗原的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟一：將4-溴苯甲醛或4-碘苯甲醛與丙烯醛縮二乙醇或通式（I)所示的化合物 在存在Heck反應(yīng)配體、醋酸鈀和縛酸劑的條件下進行Heck反應(yīng)獲得化合物1 ; 步驟二：將化合物1與N，N-二甲基苯胺進行縮合反應(yīng)獲得化合物2 ; 步驟三：將化合物2溶解于1,4-二氧六環(huán)中，加飽和氫氧化鈉溶液至pH值為9-10,反 應(yīng)獲得通式（II)所示的隱性孔雀石綠半抗原；
其中，在通式（I)中，n為1-3的整數(shù)，m為0或1 ;在通式（II)中，n為2-4的整數(shù)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，相對于lmol的4-溴苯甲醛或4-碘 苯甲醛，丙烯醛縮二乙醇或通式（I)所示的化合物的用量為2.5-4mol;N，N-二甲基苯胺 的用量為1. 5-2. 5mol，飽和氫氧化鈉溶液的用量為2. 5-4mol。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，步驟一包括：將4-溴苯甲醛或 4-碘苯甲醛、Heck反應(yīng)配體與醋酸鈀的混合物在保護氣下與Heck反應(yīng)溶劑接觸獲得反應(yīng) 混合物1，將所述反應(yīng)混合物1依次與丙烯醛縮二乙醇或通式（I)所示的化合物、三乙胺 接觸混勻，在80-130°C的溫度下攪拌反應(yīng)24-48h獲得反應(yīng)混合物2 ;將反應(yīng)混合物2與冰 水混合后用有機溶劑萃取分離有機相，用展開劑對有機相進行過柱分離，收集洗脫液后干 燥獲得化合物1。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟二包括：將化合物1與無水氯 化鋅的混合物在保護氣存在下與無水乙醇接觸獲得反應(yīng)混合物3,將所述反應(yīng)混合物3與 N，N-二甲基苯胺接觸混勻，在80-130°C的溫度下攪拌反應(yīng)12-48h獲得反應(yīng)混合物4,將所 述反應(yīng)混合物4干燥后用甲醇溶解，水洗后獲得化合物2。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟三包括：將化合物2溶解于 1，4-二氧六環(huán)中，加飽和氫氧化鈉溶液至pH值為9-10,15-30°C的溫度下攪拌反應(yīng)6-12h 獲得混合物5,用1M稀鹽酸調(diào)整pH至5后與冰水接觸攪拌至沉淀析出，過濾干燥后獲得通 式（II)所示的隱性孔雀石綠半抗原。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的制備方法，其特征在于，相對于lmol的4-溴苯甲醛或 4-碘苯甲醛，Heck反應(yīng)配體的用量為0.8-1. 2mol，縛酸劑的用量為1.8-3mol，醋酸鈀的用 量為0? 025-0. 035mol，無水氯化鋅的用量為3-4mol〇
7. 根據(jù)權(quán)利要求4-6中任意一項所述的制備方法，其特征在于，利用丙烯醛縮二乙醇 制備隱性孔雀石綠半抗原。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1、2、4或5所述的制備方法，其特征在于，所述縛酸劑為三乙胺或 K2C03〇
9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述Heck反應(yīng)溶劑為N，N-二甲基甲 酰胺或無水乙腈。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述有機溶劑為乙酸乙酯，所述展 開劑由石油醚和乙酸乙酯組成，石油醚和乙酸乙酯的體積比為4:1，所述Heck反應(yīng)配體為 四丁基氯化銨或三苯基膦。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種隱性孔雀石綠半抗原的制備方法，采用了Heck反應(yīng)進行活性手臂的延長，反應(yīng)條件溫和，有機溶劑用量少，反應(yīng)副產(chǎn)物少，操作步驟簡單；而且通過對產(chǎn)物的純化方法進行優(yōu)化，避免了純化過程中有機溶劑的大量使用，有效的減少了環(huán)境污染物的排放。
【IPC分類】G01N33-531
【公開號】CN104569372
【申請?zhí)枴緾N201410854438
【發(fā)明人】陳剛, 朱丹, 王凱強, 李強強, 逄秀梅, 魏麗娟
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月31日