一種甲氨蝶呤均相酶免疫檢測(cè)試劑及其制備和檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種甲氨蝶嶺檢測(cè)試劑及其制備和檢測(cè)方法，具體設(shè)及一種甲氨蝶嶺 均相酶免疫檢測(cè)試劑及其制備和檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 甲氨蝶嶺（Methotrexate)結(jié)構(gòu)式如式（III)所示：
[0003]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種甲氨蝶呤均相酶免疫檢測(cè)試劑，其特征在于，包括：抗甲氨蝶呤特異性抗體、用 于檢測(cè)抗甲氨蝶呤特異性抗體-甲氨蝶呤復(fù)合物的指示試劑；上述抗甲氨蝶呤特異性抗體 由甲氨蝶呤免疫原免疫動(dòng)物得到，甲氨蝶呤免疫原的結(jié)構(gòu)式如式（I)所示： I
式中，載體為具有免疫原性的蛋白質(zhì)；上述指示試劑選自酶試劑、放射性同位素試劑、 熒光試劑或化學(xué)發(fā)光試劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲氨蝶呤均相酶免疫檢測(cè)試劑，其特征在于，上述指示試 劑選自酶試劑，包括：酶標(biāo)偶聯(lián)物和酶的底物；上述酶標(biāo)偶聯(lián)物包括葡萄糖-6-磷酸脫氫 酶-半抗原酶標(biāo)偶聯(lián)物；上述酶的底物為葡萄糖-6-磷酸；所述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半 抗原酶標(biāo)偶聯(lián)物由葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與甲氨蝶呤衍生物反應(yīng)形成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的甲氨蝶呤均相酶免疫檢測(cè)試劑，其特征在于，上述甲氨蝶呤 衍生物的結(jié)構(gòu)式如式（II)所示：
4. 甲氨蝶呤衍生物，結(jié)構(gòu)式如式（II)所示：
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的甲氨蝶呤衍生物，其特征在于，其合成路線為：
6. -種甲氨蝶呤均相酶免疫檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： (1)權(quán)利要求4或5所述的甲氨蝶呤衍生物的合成與純化，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定； (2) 甲氨蝶呤免疫原的合成：使甲氨蝶呤衍生物的末端羧基與具有免疫原性的蛋白質(zhì) 載體連接； (3) 用甲氨蝶呤免疫原免疫動(dòng)物，制備并純化抗甲氨蝶呤特異性抗體； (4) 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物的制備：制備葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液， 制備甲氨蝶呤衍生物溶液，使葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與甲氨蝶呤的末端羧基連接，純化連 接產(chǎn)物； (5) 甲氨蝶呤均相酶免疫檢測(cè)試劑的制備： 試劑A的制備：由抗甲氨蝶呤特異性抗體和均相酶底物混合而成；試劑B的制備：由葡 萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物與Tris緩沖液混合而成。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種甲氨蝶呤均相酶免疫檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在 于，所述的步驟（2)中，蛋白質(zhì)載體為BSA，具體合成步驟如下： a. 稱取2. 72g磷酸二氫鉀、4. 26g磷酸氫二鈉、8. 5g氯化鈉、0. 95g氯化鎂，共同溶解于 1L去離子水中，調(diào)節(jié)pH至7. 4,制成緩沖溶液A; b. 稱取3mgBSA，室溫下溶解于3mL上述緩沖溶液A中，制成BSA溶液； c. 稱取3mg甲氨蝶呤衍生物，溶解于300ul上述緩沖溶液A中，制成甲氨蝶呤衍生物溶 液； d. 當(dāng)上述甲氨蝶呤衍生物溶液剛變澄清時(shí)，將其逐滴加入上述BSA溶液中，然后將此 混合溶液在2-8°C下攪拌1小時(shí)； e. 將反應(yīng)后的上述混合溶液用上述緩沖溶液A進(jìn)行透析，透析后所得溶液即為甲氨蝶 呤免疫原溶液，在甲氨蝶呤免疫原溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)〇. 1%的NaN3，于-20°C下儲(chǔ)存。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種甲氨蝶呤均相酶免疫檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在 于，所述的步驟（4)具體過程為： a. 稱取1. 09g磷酸二氫鉀、1. 70g磷酸氫二鈉、8. 5g氯化鈉、0. 95g氯化鎂，共同溶解于 1L去離子水中，調(diào)節(jié)pH至7. 4,制成緩沖溶液B; b. 稱取3mg葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，室溫下溶解于3mL上述緩沖溶液B中，制成葡萄 糖-6-磷酸脫氫酶溶液； c. 稱取3mg甲氨蝶呤衍生物，溶解于300ul上述緩沖溶液B中，制成甲氨蝶呤衍生物溶 液； d. 當(dāng)上述甲氨蝶呤衍生物溶液剛變澄清時(shí)，將其逐滴加入上述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 溶液中，然后將此混合溶液在2-8°C下攪拌1小時(shí)； e. 將反應(yīng)后的上述混合溶液用上述緩沖溶液B進(jìn)行透析，透析后所得溶液即為葡萄 糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物溶液，在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物溶液中 加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)〇. 5 %的BSA和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 1 %的NaN3，于2-8 °C下儲(chǔ)存。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種甲氨蝶呤均相酶免疫檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在 于，步驟（5)的具體過程如下： 試劑A的制備：將4. 036g11. 25mM的氧化態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、1. 71lg 11. 25mM的葡萄糖-6-磷酸用1L55mM、pH= 8. 0的Tris緩沖液溶解制成均相酶底物； 將制備的抗甲氨蝶呤特異性抗體加到上述均相酶底物中，抗體與均相酶底物的體積比為 1:100 ?1:10000 ; 試劑B的制備：將制備的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物加到120mM、pH= 8. 2 的Tris緩沖液中，上述偶聯(lián)物與Tris緩沖液的體積比為1:100?1:10000。
10.利用權(quán)利要求1至3任意一項(xiàng)所述的甲氨蝶呤均相酶免疫檢測(cè)試劑的檢測(cè)方法，其 特征在于，包括以下步驟： (1) 將待測(cè)樣本與抗甲氨蝶呤特異性抗體接觸； (2) 根據(jù)待測(cè)樣本中甲氨蝶呤與抗甲氨蝶呤特異性抗體的結(jié)合情況，利用指示試劑判 斷樣本中甲氨蝶呤的含量； 所述待測(cè)樣本為血清、血漿、唾液或尿液； 上述酶試劑包括：酶標(biāo)偶聯(lián)物和酶的底物；上述酶標(biāo)偶聯(lián)物包括葡萄糖-6-磷酸脫氫 酶-半抗原酶標(biāo)偶聯(lián)物；上述酶的底物為葡萄糖-6-磷酸； 上述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標(biāo)偶聯(lián)物由葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與甲氨蝶呤 衍生物反應(yīng)形成，上述甲氨蝶呤衍生物的結(jié)構(gòu)式如式（II)所示：
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種甲氨蝶呤檢測(cè)試劑及其制備和檢測(cè)方法，具體涉及一種甲氨蝶呤均相酶免疫檢測(cè)試劑及其制備和檢測(cè)方法，包括：抗甲氨蝶呤特異性抗體、用于檢測(cè)抗甲氨蝶呤特異性抗體-甲氨蝶呤復(fù)合物的指示試劑；上述抗甲氨蝶呤特異性抗體由甲氨蝶呤免疫原免疫動(dòng)物得到。發(fā)明的有益之處在于：發(fā)明的甲氨蝶呤免疫原特異性強(qiáng)、免疫原性高，制備出的抗甲氨蝶呤特異性抗體特異性強(qiáng)、效價(jià)高，并且與常見的62種藥物無任何交叉反應(yīng)；含有上述抗甲氨蝶呤特異性抗體的均相酶免疫檢測(cè)試劑可以方便、快速、準(zhǔn)確地確定樣品中的甲氨蝶呤含量，并且可以在全自動(dòng)生化分析儀上同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品，實(shí)現(xiàn)甲氨蝶呤的高通量快速化測(cè)定，準(zhǔn)確度高，特異性強(qiáng)，精確度和檢測(cè)效率有了較大的提高。
【IPC分類】G01N33-531, G01N33-544
【公開號(hào)】CN104569373
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510039620
【發(fā)明人】虞留明, 盧忠心, 胡瑜, 婁金麗, 成志鵬
【申請(qǐng)人】蘇州博源醫(yī)療科技有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2015年1月27日