用于動物病原體檢測的無害化陽性對照品的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫學檢測領域，具體地說，涉及一種用于動物病原體檢測的無害化陽性對照品及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002]隨著免疫學技術的發(fā)展，利用酶聯(lián)免疫學和化學發(fā)光方法對各種獸類血清中所含病原體抗體的檢測試劑日益增多，主要有以下兩類。第一類為動物免疫后對免疫效果進行評價的檢測試劑，如常用的口蹄疫、豬瘟抗體檢測試劑、犬和貓的狂犬病毒抗體檢測試劑盒等；還有一類為鑒別動物感染病原體的檢測試劑，如常用的各類牛、羊、豬的各種病原體感染檢測試劑盒。這些試劑盒主要采用雙抗原夾心法、間接法或捕獲法。
[0003]間接法具體操作是將特異性抗原與固相載體聯(lián)結，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。加稀釋的受檢血清，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。加酶標抗抗體，使固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關。最后加入底物顯色。
[0004]雙抗原夾心法是指利用酶聯(lián)免疫吸附法、化學發(fā)光法或磁微粒酶免疫技術等基于抗原抗體反應原理，以特定病原體的特異性抗體為檢測目標，通過包被和標記該病原體的特異性抗原來對血清或血漿樣本中病原體特異性抗體進行體外檢測的試劑。
[0005]捕獲法是指利用酶聯(lián)免疫吸附法、化學發(fā)光法或磁微粒酶免疫技術等基于抗原抗體反應原理，以特定病原體的特異性IgM抗體為檢測目標，通過包被抗IgM抗體來對血清或血漿樣本中病原體特異性IgM抗體進行體外檢測的試劑。
[0006]以上三種方法所采用的陽性對照往往是該檢測試劑所測物種該類抗原陽性的血清加工后獲得的，有些病原體血清屬于高風險并且不易獲取，即使經(jīng)過滅活也有潛在生物危害，因此獲取穩(wěn)定、安全的陽性對照將很大程度提升試劑的安全性。
【發(fā)明內容】
[0007]為了解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種用于動物病原體檢測的無害化陽性對照品及其制備方法與應用。
[0008]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種用于檢測病原體的無害化陽性對照品，由包被物和標記物的抗體及抗該抗體的二抗按照1:1:1-8的摩爾比混合制成。
[0009]所述包被抗原為待檢測病原體抗原。
[0010]所述包被物和標記物的抗體及抗該抗體的二抗利用免疫學方法制備得到。
[0011]本發(fā)明所述陽性對照品的制備方法包括如下步驟:
[0012](I)制備包被物抗體和標記物的抗體；
[0013](2)制備二抗；
[0014](3)陽性對照的獲得:將包被物抗體和標記物的抗體以及二抗混合并加入小牛血清和硫柳汞后用生理鹽水稀釋作為陽性對照
[0015]上述方法中，步驟(3)包被物抗體、標記物抗體以及二抗按照1:1:1-8的摩爾比混入口 ο
[0016]進一步地，步驟(3)中按照與抗體混合液的體積比10:1小牛血清，按照與抗體混合液的體積比2:1加入10%的硫柳汞后，用生理鹽水稀釋至總體積為抗體混合液的體積的200倍后作為陽性對照。
[0017]優(yōu)選地，本發(fā)明所述包被物抗體和標記物的抗體為單抗；所述二抗為多抗。
[0018]含有本發(fā)明陽性對照品的動物病原體檢測試劑盒也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0019]進一步地，所述檢測試劑盒為ELISA檢測試劑盒。
[0020]本發(fā)明還提供了上述陽性對照品在無害化檢測動物病原體中的應用。陽性對照品的濃度為0.05-20mg/mlo優(yōu)選地，陽性對照品的濃度為0.5mg/ml。
[0021]本發(fā)明所采用的包被物和標記物的單抗或多抗特點如下:可與包被物和標記物反應的基因表達、化學修飾、免疫學方法獲得的抗體。
[0022]本發(fā)明所采用的包被物和標記物的單抗或多抗的二抗特征如下:可與包被物和標記物的單抗或多抗反應的基因表達、化學修飾、免疫學方法獲得的抗體。
[0023]本發(fā)明的有益效果在于:利用免疫學方法制備包被物和標記物單抗或多抗和制備它們的二抗，按照1:1:1-8的摩爾比混合，添加其他輔料稀釋后作為陽性對照，解決陽性對照材料的來源受限并避免使用含有動物病原的血清作為陽性對照的潛在風險。本發(fā)明采用嚴格檢驗的實驗動物進行抗體制備從源頭上保障了生物安全性，這些來源與實驗動物的抗體制成的陽性對照不存在生物危害風險，同時，和從病毒感染者身體內采集相比較來源更廣泛，抗體效價更高，完全可以滿足試劑盒中作為陽性對照的需要。
【具體實施方式】
[0024]以下實施例進一步說明本發(fā)明的內容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0025]若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。
[0026]實施例1無害化陽性對照品的制備
[0027]通過利用免疫學方法制備鼠抗包被物和標記物單抗，并制備兔抗鼠多抗，按照包被物單抗:標記物單抗:多抗比為1:1:1加入混合在一起作為陽性對照，解決陽性對照材料的來源并避免使用陽性血清潛在的風險。
[0028]1、鼠抗包被物和標記物單抗的獲得:以包被物和標記物作為免疫抗原，免疫BALB/c小鼠，將免疫小鼠的脾臟淋巴細胞與骨髓瘤細胞相融合，然后用有限稀釋方法獲得可分泌紅細胞單抗的雜交瘤。具體步驟如下:
[0029]取0.2mg/ml的包被物和標記物，初次免疫采用皮下多點注射，0.1ml/點，共四點。2周后第二次免疫，劑量同上，腹腔注射。再2周后第三次免疫，劑量同上，腹腔注射(5?7天后采血測其效價)。再過2?3周后加強免疫，劑量0.5ml，腹腔注射。最后一次加強免疫，劑量0.5ml，腹腔注射，3天后小鼠拉頸處死，無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗一次，將脾臟研碎，過不銹鋼篩網(wǎng)，離心，細胞用培養(yǎng)液洗2次，計數(shù)，取I X 17脾淋巴細胞懸液備用，準備融合。
[0030]將6?10周大的BALB/C小鼠拉頸處死，浸泡在75%酒精內，3?5min，用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜，用無菌注射器注入5?6ml預冷的培養(yǎng)液(嚴禁刺破腸管)反復沖洗，吸出沖洗液放入1ml離心管，1200rpm/分離5?6min，用20%小牛血清(NCS)的培養(yǎng)液混懸，調整細胞數(shù)至I X 107/ml，加入96孔板，100 μ I/孔放入37°C CO2孵箱培養(yǎng)，制得飼養(yǎng)細胞。
[0031]將骨髓瘤細胞與脾細胞按1:10或1:5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養(yǎng)液洗I次，離心，1200rpm, 8min ;棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇(PEG)濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略松動。90s內加入37°C預溫的lml45%PEG (分子量4000)溶液，邊加邊輕微搖動，37°C水浴作用90s，加37°C預溫的不完全培養(yǎng)液以終止PEG作用，每隔2min分別加入lml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml，離心，800rpm, 6min。棄上清，用含20%小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液重懸細胞。將上述細胞加到已有飼養(yǎng)細胞層的96孔板內，每孔加ΙΟΟμΙ。一般一個免疫脾臟可接種4塊96孔板。將培養(yǎng)板置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，完成融合。
[0032]在用HAT選擇培養(yǎng)I?2天內，將有大量瘤細胞死亡，3?4天后瘤細胞消失，雜交細胞形成小集落，HAT選擇培養(yǎng)液維持7?10天后應換用HT培養(yǎng)液，再維持2周，改用一般培養(yǎng)液。在上述選擇培養(yǎng)期間，雜交瘤細胞布滿孔底1/10面積時，即可用篩選出所需要的雜交瘤細胞