分析標(biāo)記的制作方法
【專利說(shuō)明】分析標(biāo)記
[0001] 本發(fā)明涉及分析標(biāo)記，具體地講，涉及基于免疫分析法中所用的碳粒子的分析標(biāo) 記。
[0002] 多個(gè)分析系統(tǒng)使用碳粒子作為檢測(cè)綴合物（或標(biāo)記）。一個(gè)這樣的例子是使用眼 睛可見(jiàn)的碳粒子的側(cè)向流動(dòng)條。另一個(gè)例子是在WO 2004/090512中所述的分析系統(tǒng)，該系 統(tǒng)使用具有熱電/壓電換能器的裝置以用于檢測(cè)在分析過(guò)程中通過(guò)照明標(biāo)記所產(chǎn)生的熱。 碳粒子非常適合該系統(tǒng)，因?yàn)樵谝欢ǖ牟ㄩL(zhǎng)范圍內(nèi)，包括光譜的紫外、可見(jiàn)和紅外部分，碳 粒子是電磁輻射的強(qiáng)吸收劑。另外，碳粒子不是特別質(zhì)量致密的，所以它們能夠很好地懸浮 在樣品中并且不會(huì)過(guò)度沉淀，過(guò)度沉淀會(huì)在使用熱電/壓電換能器的分析系統(tǒng)中引起干涉 作用。
[0003] 通常認(rèn)為粒子碳具有可吸收疏水性材料的"活性"表面。例如，活性炭用于抽油煙 機(jī)中的過(guò)濾器中，并且碳粒子用于純化化學(xué)反應(yīng)混合物。在后一種情況中，通常通過(guò)添加 吸收雜質(zhì)的活性炭來(lái)從反應(yīng)容器中移除聚合物雜質(zhì)和/或疏水性雜質(zhì)。然后通過(guò)過(guò)濾移除 炭。
[0004] 因此，碳粒子已在分析中使用了一段時(shí)間，不是作為標(biāo)記，而是作為移除過(guò)量的不 需要的試劑的方法。具體地講，碳粒子已用于從競(jìng)爭(zhēng)免疫分析中移除過(guò)量的放射性標(biāo)記的 試劑（例如，胰島素、葉酸、游離的T3、游離的T4)。碳粒子的這種用途在US 3,442,819、US 4, 028, 465 以及 N. Poznanski 和 W. J. Poznanski，Clin. Chem.(《臨床化學(xué)》），1969 年，第 15卷，第908-918頁(yè)中有所描述。在該技術(shù)應(yīng)用中，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)在溶液中在放射性標(biāo)記的小 分子和內(nèi)源性小分子之間進(jìn)行，在該反應(yīng)中這些分子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到固定數(shù)量的抗體。然后通 過(guò)添加已預(yù)先用葡聚糖（或其他高分子）處理過(guò)的碳粒子來(lái)移除未接合到抗體的小分子部 分。葡聚糖允許小分子而不是大分子穿過(guò)并結(jié)合到碳，所以碳-葡聚糖移除未結(jié)合的小分 子，而不是結(jié)合到抗體的小分子部分。然后過(guò)濾碳-葡聚糖，并且通過(guò)測(cè)量剩余溶液的放射 性來(lái)對(duì)結(jié)合試劑進(jìn)行定量。
[0005] 這些文獻(xiàn)向讀者提出了碳粒子對(duì)疏水性小分子具有比其對(duì)葡聚糖更大的親和力。 用于將小分子附接到膠態(tài)標(biāo)記的常用方法是，首先將小分子共價(jià)附接到較大的載體（諸如 大分子），然后將綴合物附接到標(biāo)記，即通過(guò)被動(dòng)吸附。然而，如果制備了具有疏水性小分子 的葡聚糖的共價(jià)綴合物，則可期待通過(guò)將小分子附接到碳而將綴合物結(jié)合到碳。因此，這似 乎不是制備小分子的碳綴合物的好方法，因?yàn)樾》肿涌赡苁遣豢色@得的。
[0006] 在文獻(xiàn)中存在描述使用抗體涂覆的碳粒子作為分析標(biāo)記的例子。例如，US 4, 760, 030描述了將抗體被動(dòng)吸附到碳粒子上。然而，在US 4, 760, 030中粒子需要用氨基 酸穩(wěn)定，以將抗體涂覆到粒子上。還有一些參考了印度墨汁（India-ink)分析（也稱為Geek 分析），其為碳粒子和抗體同時(shí)混合的凝集分析，并且在存在分析物的情況下發(fā)生凝集。另 夕卜，需要穩(wěn)定劑以形成碳膠體。
[0007] US 5, 252, 496、US 5, 559, 041和US 6, 506, 612也描述了結(jié)合到碳粒子的抗體。這 些專利使用Vulcan XC72碳粒子，其必須是穩(wěn)定的以在水中形成膠體。這些專利描述了使 用2%葡聚糖9, 400作為穩(wěn)定劑。US 5, 252, 496的欄13中的實(shí)例7描述了將單克隆抗體 固定至碳。概括地說(shuō)，碳粒子在具有2%葡聚糖的緩沖液中均勻分布，葡聚糖被描述為"懸 浮助劑"。2小時(shí)后加入熒光素異硫氰酸酯（FITC)并且將該懸浮液溫育12小時(shí)，然后在加 入抗體之前洗滌若干次，然后進(jìn)一步洗滌，并且將膠體儲(chǔ)存在適當(dāng)?shù)膬?chǔ)存緩沖液中。
[0008] 抗體附接至粒子的機(jī)理尚不完全清楚。首先，F(xiàn)ITC僅具有一個(gè)化學(xué)反應(yīng)官能團(tuán)， 并因此不是交聯(lián)劑，所以不存在FITC可將抗體共價(jià)連接到葡聚糖的預(yù)期機(jī)理。其次，異硫 氰酸酯通常用于與胺類(lèi)反應(yīng)（以產(chǎn)生硫脲），但也可與醇類(lèi)反應(yīng)（以產(chǎn)生硫代氨基甲酸酯） 或被水解為胺。給定12小時(shí)的溫育時(shí)間，F(xiàn)ITC將與葡聚糖上的羥基反應(yīng)或被水解?？雌?來(lái)所提出的結(jié)合機(jī)理是FITC以某種方式結(jié)合到葡聚糖碳的表面。不期望熒光素結(jié)合到葡 聚糖，所以這意味著FITC結(jié)合（被動(dòng)吸附）至碳自身的表面上。然后異硫氰酸酯基團(tuán)不可 用于結(jié)合至抗體上的賴氨酸基團(tuán)（胺）。
[0009] US 6, 506, 612還描述了粘合劑通過(guò)交聯(lián)劑共價(jià)結(jié)合至碳粒子表面上的初級(jí)被動(dòng) 吸附層的方法。第8欄第35-60行描述了此類(lèi)共價(jià)連接，其中被動(dòng)吸附層總是蛋白質(zhì)。因 此，US6, 506, 612提出，葡聚糖可首先用于穩(wěn)定碳膠體，但其最終將會(huì)被小分子（諸如FITC) 或蛋白質(zhì)分子（諸如BSA、抗生物素蛋白或抗體）替代，小分子或蛋白質(zhì)分子將比葡聚糖更 強(qiáng)力地結(jié)合到碳。US 6, 506, 612還描述了在將抗體涂覆到碳上之前用FITC預(yù)處理抗體的 方法，其作用可能是添加FITC基團(tuán)到抗體使得抗體更疏水，并因此更強(qiáng)力地結(jié)合到碳。
[0010] US 5,529,901和US 5,641，689描述了選擇碳粒子的類(lèi)型（得自德固賽公司 (Degussa)的SB4)的方法，所述碳粒子將在不添加穩(wěn)定劑（諸如葡聚糖、PEG、甘氨酸等）的 情況下在水中形成膠體。它們還描述了選擇SB4(和類(lèi)似粒子）以用于結(jié)合至分析物的結(jié) 合組分（例如抗體）的直接共軛結(jié)合。因此這些專利提出了不使用葡聚糖作為穩(wěn)定劑。事 實(shí)上，它們將使用葡聚糖以穩(wěn)定粒子描述為不必要的步驟，其可通過(guò)具體使用這些粒子而 移除。
[0011] 使用被動(dòng)吸附方法來(lái)共軛結(jié)合通常用于分析中的碳粒子，參見(jiàn)US 5, 529, 901 和US 5,641，689。該方法對(duì)于某些類(lèi)型的碳具有特異性，特別是來(lái)自德固賽贏創(chuàng)公司 (Degussa/Evo nik)的 Spezial Schwartz 4(SB4)(平均尺寸為 100-200nm 的無(wú)定形碳粒 子），其在不存在任何穩(wěn)定劑的情況下在水中形成穩(wěn)定的膠體。作為另外一種選擇，大多數(shù) 其他碳粒子需要穩(wěn)定劑，諸如洗滌劑或大分子（例如葡聚糖、PEG、甘氨酸等）。被動(dòng)吸附方 法適用于大多數(shù)基于抗體的分析，但應(yīng)當(dāng)指出的是，大部分抗體在被動(dòng)吸附期間失去活性， 因?yàn)榭贵w在結(jié)合到表面時(shí)會(huì)變性（這與抗體被動(dòng)吸附至微量滴定板的表面時(shí)發(fā)生的情況 類(lèi)似）?？捎玫慕?jīng)驗(yàn)方法是大約10%的被動(dòng)吸附抗體將是活性的，剩余的90%為非活性的， 這主要是因?yàn)榭贵w的變性。
[0012] 對(duì)于需要非常高的靈敏度的分析而言，在碳粒子上具有較高的抗體負(fù)載是有益 的，其可能需要另選的途徑來(lái)被動(dòng)吸附。較高的抗體負(fù)載驅(qū)動(dòng)抗體-抗原交互作用的熱力 學(xué)平衡。每個(gè)粒子較高的抗體負(fù)載是優(yōu)選的，而不是簡(jiǎn)單地添加更多的粒子，使得系統(tǒng)不會(huì) 負(fù)載過(guò)多的粒子（從而導(dǎo)致非特異性結(jié)合）。另外，被動(dòng)吸附抗體靠近碳的表面，這可使抗 體完全空間受阻。就減少空間位阻而言，使抗體遠(yuǎn)離碳的表面可能是有益的。最后，使抗體 被動(dòng)吸附到碳上導(dǎo)致抗體的變性，這可潛在地促進(jìn)非特異性結(jié)合。
[0013] 在免疫性（也稱為夾心或試劑-過(guò)量）免疫分析中，如在W0 2004/090512中所述， 抗體（或類(lèi)似試劑）位于傳感器上，而另一種抗體在碳粒子上。然后，在存在待測(cè)分析物的 情況下，碳粒子結(jié)合到傳感器。兩種抗體均以大量過(guò)量的方式存在。
[0014] 在競(jìng)爭(zhēng)分析中，存在（a)抗體在碳粒子上而分析物的類(lèi)似物（即小分子）在傳感 器上，或（b)類(lèi)似物（即小分子）在碳粒子上而抗體在傳感器上。結(jié)合在不存在分析物的 情況下發(fā)生，并且在存在分析物的情況下受到干擾（減少）。
[0015] 術(shù)語(yǔ)"小分子"為免疫分析領(lǐng)域中的技術(shù)術(shù)語(yǔ)，它用于區(qū)分可在夾心分析中被測(cè)量 的分子和那些不能被測(cè)量的分子。為了在夾心分析中進(jìn)行測(cè)量，分子必須足夠大以具有兩 個(gè)或更多個(gè)可分辨的表位（抗體結(jié)合位點(diǎn)），使得兩個(gè)抗體可同時(shí)結(jié)合至分子，使得分子可 夾在捕獲抗體和報(bào)告（或標(biāo)記）抗體之間。如果分子不能形成夾心，則其就落入"小"分子 的類(lèi)別。分子量截留值為約2, 000-5, 000。
[0016] 在實(shí)施競(jìng)爭(zhēng)分析時(shí)，另外的要求是對(duì)系統(tǒng)中各種組分的水平具有更大的控制。對(duì) 結(jié)合至碳的抗體，當(dāng)使用被動(dòng)吸附時(shí)更難以控制活性抗體的量。在競(jìng)爭(zhēng)分析的替代形式中， 其是必須結(jié)合到碳粒子的表面的小分子類(lèi)似物。對(duì)于小分子來(lái)說(shuō)這通常是不可能的；因?yàn)?小分子太小，它們將不能吸附到表面，或者如果小分子吸附到表面，它們不能被抗體識(shí)別。 因此，小分子通常共軛結(jié)合至較大的載體（諸如蛋白質(zhì)），然后載體結(jié)合到所關(guān)注的例如碳 粒子的表面。
[0017] 然而，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，難以通過(guò)傳統(tǒng)途徑制備小分子-碳綴合物，傳統(tǒng)途徑將其共價(jià)附 接至蛋白質(zhì)分子（例如2-巨球蛋白、脫鐵鐵蛋白、0 -半乳糖苷酶、0 -淀粉酶、膠原（綿羊 的）、伴刀豆球蛋白A、鑰孔蟲(chóng)戚血蘭素、肌球蛋白、脲酶、人甲狀腺球蛋白、豬甲狀腺球蛋白 和牛甲狀腺球蛋白）并隨后將這些蛋白質(zhì)結(jié)合至碳粒子的表面。這可能是因?yàn)樾》肿邮翘?別疏水的（例如，類(lèi)固醇、熒