一種用于maldi-tof ms檢測的植物線蟲前處理方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于質(zhì)譜分析技術(shù)領(lǐng)±或，特別是涉及一種用于MALD1-T0FMS (Matrix-assisted laser desorpt1n/1nizat1n time-of-fIight massspectrometry的縮寫，中文全稱為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜)檢測的植物線蟲前處理方法。
【背景技術(shù)】
[0002]MALD1-TOF MS儀器主要由兩部分組成:基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源(MALDI)和飛行時間質(zhì)量分析器(TOF)。MALDI的原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過程。它是一種軟電離技術(shù)，適用于混合物及生物大分子的測定。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達檢測器的飛行時間不同而被檢測。MALD1-T0F-MS具有靈敏度高、準確度高及分辨率高等特點，為生命科學(xué)等領(lǐng)域提供了一種強有力的分析測試手段。近年來，該技術(shù)逐漸被用于植物細菌、真菌和線蟲的檢測當中。但檢測前對植物線蟲的前處理方法很難操作，使得到的結(jié)果穩(wěn)定性差、背景信號多而雜、靈敏度低從而影響對植物線蟲的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了彌補上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提出一種用于MALD1-TOF MS檢測的植物線蟲前處理方法。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)問題通過以下的技術(shù)方案予以解決:
[0005]一種用于MALD1-TOF MS檢測的植物線蟲前處理方法，包括如下步驟:
[0006](I)在滅菌的載片上滴加提取液，所述提取液的滴加量為每條所述植物線蟲滴加5-8 μ I ；
[0007](2)在體視顯微鏡下將清洗好的所述植物線蟲轉(zhuǎn)移到所述載片上的提取液中，并壓破所述植物線蟲，所述提取液用于提取所述植物線蟲的蛋白質(zhì)并將所述蛋白質(zhì)降解為多肽；
[0008](3)在體視顯微鏡下，用移液槍吸取步驟(2)中的提取液并連帶壓破的植物線蟲一起滴加在樣品板上，并晾干；
[0009](4)在晾干后的樣品板上加基質(zhì)溶液，使所述多肽分散在所述基質(zhì)溶液中，并晾干得到用于MALD1-TOF MS檢測的樣品，每條所述植物線蟲加1-1.5 μ I的所述基質(zhì)溶液。
[0010]優(yōu)選地，所述提取液選自以下群組中的一種:
[0011]三氟乙酸和滅菌水的混合溶液，在該混合溶液中，三氟乙酸的體積濃度為0.1-0.5%，余量為滅菌水；
[0012]乙醇和滅菌水的混合溶液，在該混合溶液中，乙醇的體積濃度為90-95%，余量為滅菌水；
[0013]丙酮和滅菌水的混合溶液，在該混合溶液中，丙酮的體積濃度為90-95 %，余量為滅菌水；
[0014]甲酸、乙腈和滅菌水的混合溶液，在該混合溶液中所述甲酸的體積濃度為33-37%，所述乙腈的體積濃度是48-52%，余量為滅菌水；
[0015]甲酸、異丙醇和滅菌水的混合溶液，在該混合溶液中所述甲酸的體積濃度為17-22%,所述異丙醇的體積濃度是33-35%，余量為滅菌水。
[0016]優(yōu)選地，步驟(4)中的所述基質(zhì)溶液是由以下形成:將適用于多肽的基質(zhì)加入一溶劑中直到所述基質(zhì)過飽和。
[0017]進一步優(yōu)選地，所述基質(zhì)為α -氰基-4-輕基肉桂酸(α -cyano-4-hydroxycinnamicacid, CHCA)、芥子酸(sinapinic acid)、阿魏酸(Ferulic Acid)、2_ (4-輕基亞胺)苯甲酸(2_ (4-hydroxyphenylazo) benzoic acid, HABA)、5_ 氯 _2_ 疏基苯丙噻挫(5-chloro_2-mercaptobenzothiazole, CMBT)。
[0018]進一步優(yōu)選地，所述溶劑選自以下群組中的一種:
[0019]乙腈、三氟乙酸和滅菌水的混合溶劑，在該混合溶劑中乙腈的體積濃度為33-50%，三氟乙酸的體積濃度為2.5-3.3%，余量為滅菌水；
[0020]乙醇和滅菌水的混合溶劑，在該混合溶劑中乙醇的體積濃度為45-55 %，余量為滅菌水；
[0021]甲醇和滅菌水的混合溶劑，在該混合溶劑中甲醇的體積濃度為45-55%，余量為滅菌水；
[0022]乙腈和滅菌水的混合溶劑，在該混合溶劑中乙腈的體積濃度為45-55%，余量為滅菌水；
[0023]四氫呋喃和滅菌水的混合溶劑，在該混合溶劑中四氫呋喃的體積濃度為45-55%，余量為滅菌水；
[0024]丙酮和滅菌水的混合溶劑，在該混合溶劑中丙酮的體積濃度為45-55%，余量為滅菌水。
[0025]樣品與基質(zhì)形成共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給樣品分子，而使樣品分子電離，共結(jié)晶薄膜的形成是檢測的關(guān)鍵。以上挑選的溶解基質(zhì)的溶劑能保護并促進基質(zhì)和樣品形成共結(jié)晶薄膜，利于檢測。
[0026]優(yōu)選地，在所述步驟(I)之前還包括清洗步驟:將所述植物線蟲轉(zhuǎn)移到離心管中，加入1-1.2mL滅菌水，禍旋5-8min，4000-5000rpm離心5_10min，去上清液；然后加入1-1.2mL滅菌水，禍旋5_8min，4000-5000rpm離心5-10min，去上清液；再加入1-1.2mL滅菌水，禍旋5_8min，4000-5000rpm離心5_10min，去上清液；最后加1-1.2mL滅菌水，備用。
[0027]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)對比的有益效果是:本發(fā)明的植物線蟲的前處理方法是針對單條植物線蟲進行的處理，將單條植物線蟲挑到載片(如載玻片)的提取液中，在體視顯微鏡下壓破線蟲，使蛋白質(zhì)釋放到提取液中，在體視顯微鏡下用移液槍將植物線蟲轉(zhuǎn)移到樣品板上，然后加基質(zhì)溶液進行后續(xù)檢測，該方法易于操作，多次重復(fù)測定后得到的結(jié)果重復(fù)性好，結(jié)果穩(wěn)定；經(jīng)過處理后的植物線蟲用MALD1-TOF MS檢測得到的多肽質(zhì)譜圖的背景信號低，由于植物線蟲中的蛋白質(zhì)被提取和水解的比較徹底，使得靈敏度較高，本發(fā)明的方法適用MALD1-TOFMS對植物線蟲的檢疫、檢測和鑒定。
【附圖說明】
[0028]圖1是本發(fā)明實施例1中的單條根結(jié)線蟲的多肽質(zhì)譜圖譜。
【具體實施方式】
[0029]下面對照附圖并結(jié)合優(yōu)選的實施方式對本發(fā)明作進一步說明。
[0030]本發(fā)明提供一種用于MALD1-TOF MS檢測的植物線蟲前處理方法，在一種實施方式中，包括如下步驟:
[0031](I)在滅菌的載片上滴加提取液，所述提取液的滴加量為每條所述植物線蟲滴加5-8 μ I ；
[0032](2)在體視顯微鏡下將清洗好的所述植物線蟲轉(zhuǎn)移到所述載片上的提取液中，并壓破所述植物線蟲，所述提取液用于提取所述植物線蟲的蛋白質(zhì)并將所述蛋白質(zhì)水解為多肽；
[0033](3)在體視顯微鏡下，用移液槍吸取步驟(2)中的提取液并連帶壓破的植物線蟲一起滴加在樣品板上，并晾干；
[0034](4)在晾干后的樣品板上加基質(zhì)溶液，使所述多肽分散在所述基質(zhì)溶液中，并晾干得到用于MALD1-TOF MS檢測的樣品，每條所述植物線蟲加1-1.5 μ I的所述基質(zhì)溶液。
[0035]其中:
[0036]提取液具有破壁功能，能促進植物線蟲中的蛋白質(zhì)釋放并進一步水解為多肽，每條植物線蟲需要的提取液的量為5-8 μ 1，在一些實施例中，可以是5 μ 1、6 μ 1、7 μ 1、8 μ I等等。
[0037]步驟⑷中的基質(zhì)溶液中的基質(zhì)是用于MALD1-TOF MS檢測的基質(zhì)，在本實施方式中，選擇適用于分散多肽的基質(zhì)，每條植物線蟲加1-1.5μ I的基質(zhì)溶液，在一些實施例中可以加 1μ1、1.2μ1、1.5μ1 等。
[0038]以下以植物根結(jié)線蟲為例對本發(fā)明進行詳細闡述。
[0039]實施例1
[0040]1.根結(jié)線蟲的清洗
[0041]將從植物中獲取的單條的根結(jié)線蟲