一種作物脂肪氧化酶同工酶lox-2比活力的定量測定方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種生化檢測方法，具體設及一種作物脂肪氧化酶同工酶LOX-2比活 力的定量測定方法。
【背景技術】
[0002] 脂肪氧化酶（LO幻是一種含非血紅素鐵的蛋白質，專一催化具有順、順-1，4-戊二 締結構的多元不飽和脂肪酸加氧反應，氧化生成具有共輛雙鍵的過氧化氨物。脂肪氧化酶 具有S種同工酶Lox-3、Lox-2、LOX-1它們廣泛存在于高等植物體內，與植物的生長發(fā)育、 植物的衰老、脂質過氧化作用和光合作用、傷害反應及其他脅迫反應等有關。Lox在成熟的 大豆種子中含量很高（占種子蛋白質含量的1%?2% )，可催化不飽和脂肪酸的加氧反 應，形成過氧化氨衍生物等揮發(fā)性物質，能直接與食品中的蛋白質和氨基酸結合，產生豆 腥味和苦澀味，降低食品的風味和營養(yǎng)價值，而且破壞了上述幾種人體必需脂肪酸，是大 豆中的抗營養(yǎng)因子。
[0003] 脂肪氧化酶的活力直接影響大豆、花生、水稻等作物種子貶藏期限和加工品質，活 力越小其對種子的影響就越小?？蒲泄ぷ髡咭呀浽谘芯窟x育培養(yǎng)出脂肪氧化酶Lox缺失的 農作物新品種，因此如何快速準確地定量檢測出脂肪氧化酶Lox活性，能為研究者提供更 加準確地檢測數(shù)據(jù)，從而提高工作效率，加快新品種的研究步伐，同時也為農作物貶藏、收 購提供準確實用的數(shù)據(jù)。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種作物脂肪氧化酶同工酶L0X-2比活力的定量測定方法。
[0005] 本發(fā)明采用的技術方案如下：
[0006] 一種作物脂肪氧化酶同工酶L0X-2比活力的定量測定方法，其特征在于，包括W 下步驟：
[0007] (1)將作物胚胎磨碎，加入提取液，研磨成勻漿，將勻漿裝入超聲波萃取蓋中，將 超聲波發(fā)射頻率設定在32-38KHZ，溫度調節(jié)控制在21-26°C，萃取時間6-9分鐘，然后轉 至具蓋離屯、管，再用提取液洗漆3-4次，洗漆液轉至具蓋離屯、管，脫色搖床振蕩9-12min， 7800-8200巧111離屯、9-llmin，靜置4-6min，取上層清液，即酶液；
[0008] (2)取提取的酶液于比色皿中，加入適量的反應液，在660皿處測定吸光值，反應 開始時記錄吸光值，取出反應體系，至離屯、管，室溫25°C避光反應，90min后再測定吸光值， W吸光值的變化表示L0X-2活力，用純水作為參比調零，W緩沖液代替酶液作為對照；
[0009] (3)測定酶液蛋白濃度：
[0010] 取適量酶液，先測定樣品280nm 0D值和260nm 0D值，再按照W下公式計算酶液蛋 白濃度：
[001U 酶液蛋白濃度（mg/mL) = 280nm 0D 值 *1. 45-0. 74*260nm 0D 值；
[0012] (4)計算酶比活力：
[0013] 按照酶比活力測定公式計算出酶比活力，
[0014] 酶比活力=(樣品Omin的OD值-樣品90min的OD值）-(對照Omin的OD值-對 照90min的0D值）/酶液蛋白濃度。
[0015] 所述的作物脂肪氧化酶同工酶L0X-2比活力的定量測定方法，其特征在于：所述 的作物為水稻或花生。
[0016] 所述的作物脂肪氧化酶同工酶L0X-2比活力的定量測定方法，其特征在于：所述 的提取液的配制方法為；取甘油l〇-15ml，Tween-202. 5ml，用P冊.0的磯酸緩沖液定容至 100ml，經磁力攬拌器攬拌均勻，得LOX-2提取液；
[0017] 所述的抑6. 0的磯酸緩沖液的制備；化2冊〇471. 64g/L，NaH2P〇431. 21g/L，取8. 812g 化2冊〇4,27. 371g化H2PO4,加水溶解，定容至1000ml即可。
[001引所述的作物脂肪氧化酶同工酶LOX-2比活力的定量測定方法，其特征在于：所述 的反應液的制備方法為；將抑6.0磯酸緩沖液、亞油酸納、lOOuM亞甲基蘭、丙酬，按照 5:1:0. 5:1 (v/v)的比例混合均勻，每25ml緩沖液加入150m曲DT，得L0X-2反應液，所述的 亞油酸鋼的配制方法：定量稱取70mg亞油酸，再加入等量Tween-20,再加入4ml無氧水，充 分混勻，在加入0. 5N的化0H約0. 55ml至溶液變澄清，再定容至25ml，等量，分裝至-20°C 冷臧，待用。
[0019] 本發(fā)明的原理：利用脂肪氧化酶L0X-2能偶聯(lián)氧化亞甲基藍產生變色反應，該反 應在660nm處有一吸收峰，測定其吸光值的變化率可W反映其催化速率。
[0020] 本發(fā)明的有益效果；本發(fā)明方法能快速、準確、定量地檢測出脂肪氧化酶L0X-2比 活力，其過程簡單，成本低，其精確度明顯優(yōu)于已有的相關檢測技術；能為研究者提供更加 準確地檢測數(shù)據(jù)，能提高工作效率，加快L0X-2缺失的新品種選育步伐，同時也為農作物貶 藏、收購提供更加準確實用的數(shù)據(jù)。
【具體實施方式】
[0021] 1、配制反應液、提取液
[0022]
【主權項】
1. 一種作物脂肪氧化酶同工酶L0X-2比活力的定量測定方法，其特征在于，包括以下 步驟： (1) 將作物胚胎磨碎，加入提取液，研磨成勻漿，將勻漿裝入超聲波萃取釜中，將 超聲波發(fā)射頻率設定在32-38KHZ，溫度調節(jié)控制在21-26°C，萃取時間6-9分鐘，然后轉 至具蓋離心管，再用提取液洗滌3-4次，洗滌液轉至具蓋離心管，脫色搖床振蕩9-12min， 7800-8200 rpm離心9-llmin，靜置4-6 min，取上層清液，即酶液； (2) 取提取的酶液于比色皿中，加入適量的反應液，在660nm處測定吸光值，反應開始 時記錄吸光值，取出反應體系，至離心管，室溫25°C避光反應，90min后再測定吸光值，以吸 光值的變化表示LOX-2活力，用純水作為參比調零，以緩沖液代替酶液作為對照； (3)測定酶液蛋白濃度： 取適量酶液，先測定樣品280nm OD值和260nm OD值，再按照以下公式計算酶液蛋白 濃度： 酶液蛋白濃度（11^/1111〇=28〇11111〇0值*1.45-〇.74*26〇11111〇0值 ； (4)計算酶比活力： 按照酶比活力測定公式計算出酶比活力， 酶比活力=酶比活力=(樣品Omin的OD值-樣品90min的OD值)-(對照Omin的OD 值-對照90min的OD值）/酶液蛋白濃度。
2. 根據(jù)權利要求1所述的作物脂肪氧化酶同工酶LOX-2比活力的定量測定方法，其特 征在于：所述的作物為水稻或花生。
3. 根據(jù)權利要求1所述的作物脂肪氧化酶同工酶LOX-2比活力的定量測定方法，其特 征在于：所述的提取液的配制方法為：取甘油l〇-15ml，Tween-20 2. 5ml，用PH6. 0的磷酸緩 沖液定容至l〇〇ml，經磁力攪拌器攪拌均勻，得LOX-2提取液； 所述的PH6. 0的磷酸緩沖液的制備：Na2HP04 71. 64g/L，NaH2P04 31. 21g/L，取8. 812g Na2HP04，27.371g NaH2P04,加水溶解，定容至1000ml即可。
4. 根據(jù)權利要求1所述的作物脂肪氧化酶同工酶LOX-2比活力的定量測定方法，其特 征在于：所述的反應液的制備方法為：將pH 6. 0的磷酸緩沖液、亞油酸納、100 yM亞甲基 蘭、丙酮，按照5:1:0. 5:1 (v/v)的比例混合均勻，每25ml緩沖液加入150mgDDT，得LOX-2 反應液，所述的亞油酸鈉的配制方法：定量稱取70mg亞油酸，再加入等量Tween-20,再加入 4ml無氧水，充分混勻，在加入0. 5N的NaOH約0. 55ml至溶液變澄清，再定容至25ml，等量， 分裝至-20 °C冷藏，待用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種作物脂肪氧化酶同工酶LOX-2比活力的定量測定方法。首先將作物磨碎加入提取液中磨成漿料，再超聲助體，離心分離，得到酶液，將酶液放入比色皿中，分別測定反應前后在660nm處的吸光值，根據(jù)公式測定酶液蛋白濃度，最后按照酶比活力測定公式計算出酶比活力，本發(fā)明方法能快速、準確、定量地檢測出脂肪氧化酶LOX-2比活力，其過程簡單，成本低，其精確度明顯優(yōu)于已有的相關檢測技術。
【IPC分類】G01N21-31, G01N21-75
【公開號】CN104596960
【申請?zhí)枴緾N201510035667
【發(fā)明人】張瑛, 滕斌, 吳敬德, 宣紅, 周俊峰
【申請人】安徽省農業(yè)科學院水稻研究所
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2015年1月24日