一種檢測(cè)牛奶中卡那霉素的樣本前處理方法及使用其的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)食品中卡那霉素的的樣本前處理方法及使用其的檢測(cè)方法, 尤其適用于檢測(cè)牛奶中的卡那霉素。
【背景技術(shù)】
[0002] 卡那霉素在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和水產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用比較廣泛,也常被添加到飼料中促進(jìn)動(dòng) 物生長(zhǎng)發(fā)育,但殘留在畜產(chǎn)品中的抗生素被人類長(zhǎng)期食用后將對(duì)人類健康產(chǎn)生巨大危害。 因此,歐盟、美國(guó)FDA以及日本等許多國(guó)家和機(jī)構(gòu)對(duì)該類抗生素在食品中的殘留限量都作 了明確的規(guī)定。我國(guó)也加強(qiáng)了該類抗生素在牛奶以及其它動(dòng)物源性食品中的殘留監(jiān)控。
[0003] 目前,卡那霉素的檢測(cè)方法很多,如微生物法、酶聯(lián)免疫法、氣相色譜法、高效液相 色譜法以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。檢測(cè)牛奶中卡那霉素時(shí),通常樣品前處理比較復(fù)雜,且 最終回收率往往不盡人意。在《GB/T 22969-2008奶粉和牛奶中鏈霉素、雙氫鏈霉素和卡那 霉素殘留量的測(cè)定之液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》中,樣品經(jīng)磷酸溶液提取并除去蛋白后,上清 液需分別通過(guò)苯磺酸型固相萃取柱和羧酸型固相萃取柱的凈化程序,檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)、 操作步驟繁瑣,不能滿足日常快速檢測(cè)的要求。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)牛奶中卡那霉素的樣本前處理方法,其簡(jiǎn)單快速, 且可有效保留樣本中的卡那霉素。
[0005] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)牛奶中卡那霉素的方法,其操作簡(jiǎn)單快速, 且回收率和精密度較高。
[0006] 本發(fā)明提供了一種檢測(cè)牛奶中卡那霉素的樣本前處理方法,包括:取待測(cè)牛奶樣 品,加入磷酸水溶液振蕩提取8至10分鐘,再加入三氯乙酸水溶液,混合30秒后離心,取離 心后的上清液經(jīng)濾紙過(guò)濾,得到濾液;將濾液用混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱凈化,得到凈 化液;以及將凈化液在40°C水浴中氮?dú)獯蹈?,再加入定溶液,渦旋溶解后經(jīng)0. 22 μ m水系濾 膜過(guò)濾,得到待測(cè)液;定溶液的配制方法為:取4毫升甲酸,用0. 01摩爾/升的庚烷磺酸鈉 水溶液定容至100毫升。
[0007] 在檢測(cè)牛奶中卡那霉素的樣本前處理方法的一種示意性實(shí)施方式中,磷酸水溶液 中磷酸的體積分?jǐn)?shù)為5%,處理每克待測(cè)牛奶樣品需要磷酸水溶液的量為3. 75毫升。
[0008] 在檢測(cè)牛奶中卡那霉素的樣本前處理方法的一種示意性實(shí)施方式中,三氯乙酸水 溶液中三氯乙酸的濃度為1克/毫升,處理每克待測(cè)牛奶樣品需要三氯乙酸水溶液的量為 0· 375暈升。
[0009] 在檢測(cè)牛奶中卡那霉素的樣本前處理方法的一種示意性實(shí)施方式中,離心的轉(zhuǎn)速 為4000至5000轉(zhuǎn)/分鐘,離心時(shí)長(zhǎng)為8至10分鐘。
[0010] 在檢測(cè)牛奶中卡那霉素的樣本前處理方法的一種示意性實(shí)施方式中,凈化的步驟 為:將濾液加入已活化的混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱,控制流速不高于2毫升/分鐘,待 濾液全部通過(guò)后,依次用3毫升體積分?jǐn)?shù)為2%的甲酸水溶液和3毫升甲醇洗滌混合型陽(yáng)離 子交換固相萃取柱,棄去全部流出液,最后用3毫升體積分?jǐn)?shù)為5%的氨化甲醇溶液洗脫,收 集洗脫液,得到凈化液。
[0011] 在檢測(cè)牛奶中卡那霉素的樣本前處理方法的一種示意性實(shí)施方式中,混合型陽(yáng)離 子交換固相萃取柱活化的方法為:先用3至5毫升甲醇過(guò)柱,再用3至5毫升水過(guò)柱。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)牛奶中卡那霉素的方法,包括:用上述的檢測(cè)牛奶中卡 那霉素的樣本前處理方法對(duì)待測(cè)牛奶樣品進(jìn)行前處理,得到待測(cè)液;以及用液相色譜-串 聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)待測(cè)液中卡那霉素的含量進(jìn)行檢測(cè)。
[0013] 在檢測(cè)牛奶中卡那霉素的方法的一種示意性實(shí)施方式中,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 的色譜條件為:色譜柱=ACQUITy UPLC HSS T3柱(Φ2. IX 100毫米,1. 8微米);柱溫:40°C; 進(jìn)樣體積:1〇微升;洗脫液體:流動(dòng)相A為乙腈,流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)為0. 1%的甲酸水溶 液;梯度洗脫:〇分鐘,10%流動(dòng)相A,其余部分為流動(dòng)相B ;0至1. 5分鐘,10%至25%流動(dòng)相 A,其余部分為流動(dòng)相B ; 1. 5至2. 5分鐘,25%至100%流動(dòng)相A,其余部分為流動(dòng)相B ;2. 5 至3. 0分鐘,100%流動(dòng)相A,其余部分為流動(dòng)相B ;3. 0至3. 5分鐘,100%至10%流動(dòng)相A, 其余部分為流動(dòng)相B ;3. 5至4. 5分鐘,10%流動(dòng)相A,其余部分為流動(dòng)相B ;和流速:0. 3毫 升/分鐘。
[0014] 在檢測(cè)牛奶中卡那霉素的方法的一種示意性實(shí)施方式中,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 的質(zhì)譜條件為:離子化模式:電噴霧正離子模式;質(zhì)譜掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè);電離電壓: 3. 00千伏;離子源溫度:120°C ;去溶劑氣溫度:40(TC ;去溶劑氣:氮?dú)猓涣髁浚?00升/小 時(shí);和碰撞氣:高純Ar ;流量:50升/小時(shí)。
[0015] 在檢測(cè)牛奶中卡那霉素的方法的一種示意性實(shí)施方式中,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 的質(zhì)譜參數(shù)為:保留時(shí)間:2. 52分鐘;駐留時(shí)間:0. 05秒;錐孔電壓:40V ;母離子質(zhì)荷比: 485. 1 ;第一碰撞能量:25eV ;第一子離子質(zhì)荷比:162. 6 ;第二碰撞能量:15eV ;第二子離子 質(zhì)荷比:323. 8。
[0016] 本發(fā)明提供的一種檢測(cè)牛奶中卡那霉素的樣本前處理方法,其操作簡(jiǎn)單快速,可 有效保留樣本中的卡那霉素。
[0017] 本發(fā)明提供的一種檢測(cè)牛奶中卡那霉素的方法,其操作簡(jiǎn)單快速,且回收率和精 密度較高。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 為了對(duì)發(fā)明的技術(shù)特征、目的和效果有更加清楚的理解,現(xiàn)結(jié)合以下實(shí)施例說(shuō)明 本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】。
[0019] 第一實(shí)施例:樣本前處理方法。
[0020] 1、試劑與材料。
[0021] 卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH ;甲醇、乙腈均為色譜純;磷酸、 甲酸、乙酸、氫氧化鈉、三氯乙酸、庚烷磺酸鈉等試劑均為優(yōu)級(jí)純;實(shí)驗(yàn)室用水為去離子水; 定量濾紙為中速濾紙,直徑12. 5cm ;混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱(MCX 50mg/3mL,waters 公司)。
[0022] 體積分?jǐn)?shù)為0. 3%乙酸水溶液:加入0. 3mL乙酸至IOOmL容量瓶,用水定容至刻度, 其中所用乙酸的濃度為36% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))。
[0023] 標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取適量的卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品,用體積分?jǐn)?shù)為0. 3%乙酸水溶液配制 成100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,4°C冰箱儲(chǔ)存。使用時(shí),用體積分?jǐn)?shù)為0. 3%乙酸水溶液稀釋成 0. 01 μ g/mL、0. 02 μ g/mL、0. 05 μ g/mL、0. 10 μ g/mL 和 0. 20 μ g/mL 的五個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn) 工作液。
[0024] 磷酸水溶液:其中磷酸的體積分?jǐn)?shù)為5%;配制方法為取50mL磷酸,用水定容至 IL0
[0025] 三氯乙酸水溶液:其中三氯乙酸的濃度為1克/毫升;配制方法為稱取三氯乙酸 20g,用水定容至20mL。
[0026] 甲酸水溶液:其中甲酸的體積分?jǐn)?shù)為2% ;配制方法為吸取2mL甲酸與98mL水混 合。
[0027] 體積分?jǐn)?shù)為5%的氨化甲醇溶液:取5mL氨水至IOOml容量瓶,用甲醇定容至刻度。 其中所使用氨水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%。
[0028] 定溶液:取4mL甲酸,用0,01mol/L庚烷磺酸鈉水溶液定容至100mL。
[0029] 2、待測(cè)牛奶樣品的前處理: a、 取4克待測(cè)牛奶樣品(精確到0. 01克)于50毫升離心管中,加入15毫升磷酸水溶液 置于振蕩器上振蕩提取10分鐘;再加入1. 5毫升三氯乙酸水溶液,在渦旋混合器上混合30 秒后離心,離心的轉(zhuǎn)速為5000轉(zhuǎn)/分鐘,離心時(shí)長(zhǎng)為10分鐘;取離心后的上清液經(jīng)濾紙過(guò) 濾,得到濾液; b、 將混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱先用3毫升甲醇過(guò)柱,再用3毫升水過(guò)柱,得到已活 化的混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱;將步驟a中得到的濾液加入已活化的混合型陽(yáng)離子交 換固相萃取柱,控制流速不高于2毫升/分鐘;待濾液全部通過(guò)后,依次用3毫升甲酸水溶 液和3毫升甲醇洗滌混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱,棄去全部流出液;最后用3毫升體積分 數(shù)為5%的氨化甲醇溶液洗脫,收集洗脫液,得到凈化液; c、 將凈化液在40°C水浴中氮?dú)獯蹈?,再加?毫升定溶液,渦旋溶解后經(jīng)0. 22 μ m水系 濾膜過(guò)濾,得到待測(cè)液。
[0030] 第二實(shí)施例:樣本前處理方法。
[0031] 1、試劑與材料:與第一實(shí)施例所述"試劑與材料"相同。
[0032] 2、待測(cè)牛奶樣品的前處理: a、 取4克待測(cè)牛奶樣品(精確到0. 01克)于50毫升離心管中,加入15毫升磷酸水溶液 置于振蕩器上振蕩提取8分鐘;再加入1. 5毫升三氯乙酸水溶液,在渦旋混合器上混合30 秒后離心,離心的轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘,離心時(shí)長(zhǎng)為8分鐘;取離心后的上清液經(jīng)濾紙過(guò) 濾,得到濾液; b、 將混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱先用5毫升甲醇過(guò)柱,再用5毫升水過(guò)柱,得到已活 化的混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱;將步驟a中得到的濾液加入已活化的混合型陽(yáng)離子交 換固相萃取柱,控制流速不高于2毫升/分鐘;待濾液全部通過(guò)后,依次用3毫升甲酸水溶 液和3毫升甲醇洗滌混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱,棄去全部流出液;最后用3毫升體積分 數(shù)為5%的氨化甲醇溶液洗脫,收集洗脫液,得到凈化液; C、將凈化液在40°C水浴中氮?dú)獯蹈?,再加?毫升定溶液,渦旋溶解后經(jīng)0. 22 μ m水系 濾膜過(guò)濾,得到待測(cè)液。
[0033] 第三實(shí)施例:樣本前處理方法。
[0034] 1、試劑與材料:與第一實(shí)施例所述"試劑與材料"相同。
[0035] 2、待測(cè)牛奶樣品的前處理: a、 取4克待測(cè)牛奶樣品(精確到0. 01克)于50毫升離心管中,加入15毫升磷酸水溶液 置于振蕩器上振蕩提取9分鐘;再加入1. 5毫升三氯乙酸水溶液,在渦旋混合器上混合30 秒后離心,離心的轉(zhuǎn)速為4500轉(zhuǎn)/分鐘,離心時(shí)長(zhǎng)為9分鐘;取離心后的上清液經(jīng)濾紙過(guò) 濾,得到濾液; b、 將混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱先用4毫升甲醇過(guò)柱,再用4毫升水過(guò)柱,得到已活 化的混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱;將步驟a中得到的濾液加入已活化的混合型陽(yáng)離子交 換固相萃取柱,控制流速不高于2毫升/分鐘;待濾液全部通過(guò)后,依次用3毫升甲酸水溶 液和3毫升甲醇洗滌混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱,棄去全部流出液;最后用3毫升體積分