一種檢測天然多克隆抗癌抗體的組合物、試劑盒和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫學技術(shù)領(lǐng)域，涉及四種肽類抗原，可應(yīng)用于制備酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA)抗體檢測試劑盒，用以檢測血漿中天然多克隆抗癌抗體（NPAA)濃度。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤是威脅整個人類健康的最主要殺手之一?；诨姻察F霾等環(huán)境污染狀況 的持續(xù)存在，中國人群主要癌癥的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。據(jù)統(tǒng)計，目前我國癌癥平均每年 發(fā)病率高達3/1000以上。雖然腫瘤早期治療手段，如手術(shù)切除或放射線治療已發(fā)展的比較 成熟，能夠明顯延長病人的存活時間，但大約60%的癌癥患者在接受局部治療后仍有可能 在一年內(nèi)復(fù)發(fā)，大約90%的病人最終死于腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，如何在腫瘤治療領(lǐng)域探 索一種創(chuàng)新的控制腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的免疫支持手段，是本發(fā)明技術(shù)的主要目的之一。
[0003] 近年來的研宄表明，檢測腫瘤相關(guān)抗原或抗體具有指導(dǎo)靶向治療價值。例如，臨床 上已廣泛應(yīng)用的曲妥株單抗（Trastuzumab)和貝伐株單抗（Bevacizumab)就是以人上皮細 胞生長因子二型受體（human epidermal growth factor receptor 2，HER2)和血管內(nèi)皮 細胞生長因子 A(Vascular endothelial growth factor A，VEGF_A)為標革[1，成為臨床治 療中晚期腫瘤的重要手段。然而，由于副作用太大，這兩種單克隆抗體只能做為三線治療藥 物。因此，發(fā)展可用于防止腫瘤局部治療后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)、且副作用低的新型手段是目前亟待 解決的問題。從免疫治療領(lǐng)域解決這個難題的關(guān)鍵在于設(shè)計具有創(chuàng)新性的標靶技術(shù)實施方 案，然后發(fā)展能有效防治腫瘤的新型技術(shù)。
[0004] 血管內(nèi)皮細胞生長因子一型受體（Vascular endothelial growth factor receptor 1，VEGFR1)是一種跨膜蛋白，也是一種公認的癌細胞表達的特異性蛋白。大量的 研宄工作發(fā)現(xiàn)，許多人類實體腫瘤可大量表達VEGFR1，如肝癌，肺癌，腎癌，腸癌及乳腺癌 等。因為VEGFRl抗原表位多肽主要位于腫瘤細胞表面，可成為相應(yīng)抗體直接攻擊殺傷腫瘤 的靶點（如貝伐株單抗治療原理），也可間接地影響其功能而限制腫瘤的生長與發(fā)展。
[0005] HER2是受體型酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases)家族成員之一，也是一 種跨膜醣蛋白。目前發(fā)現(xiàn)，多種實體腫瘤可表達HER2,包括乳腺癌、膀胱癌、肺癌、胰腺癌及 頭頸部癌腫等。在現(xiàn)有技術(shù)中，曲妥株單抗對治療HER2表達陽性的乳腺癌具有顯著的療 效。
[0006] 上皮粘蛋白UMucin 1，MUCl)是一種醣化的細胞膜蛋白，多數(shù)常見上皮惡性腫瘤 細胞均大量表達MUCl，且與惡性細胞的快速增生有關(guān)。故MUCl是非常重要的腫瘤標靶，在 發(fā)展癌癥免疫療法中具有重大意義?；贛UCl蛋白為靶標的腫瘤疫苗技術(shù)目前已在國外 進入臨床試驗階段?？梢灶A(yù)見，全新的化療手段未來在腫瘤治療中的地位將越來越重要。
[0007] 越來越多的臨床研宄表明，許多惡性腫瘤可能存在原發(fā)耐藥性（intrinsic resistance)，即對初始化療藥物不敏感，因而導(dǎo)致化療失敗。原發(fā)耐藥性形成的主要機理 之一，是因為腫瘤細胞表達耐藥蛋白，例如ATP結(jié)合盒（ABC)轉(zhuǎn)運蛋白。這種轉(zhuǎn)運蛋白發(fā)揮 泵功能，可以將進入腫瘤細胞內(nèi)的化療藥物轉(zhuǎn)移到細胞外，進而保護細胞免受藥物的殺傷。 基因表達譜篩查及大量臨床病理研宄證實，多種腫瘤細胞表達ABCC3轉(zhuǎn)運蛋白，其中包括 乳腺癌、食道癌、肺癌、腎癌及頭頸部癌腫等。據(jù)此，ABCC3轉(zhuǎn)運蛋白可以成為針對具有原發(fā) 耐藥性腫瘤的免疫治療標靶。
[0008] 眾所周知，由于細胞在增殖和發(fā)育過程中可能發(fā)生突變，健康人的體內(nèi)每天都會 出現(xiàn)一定數(shù)量的癌細胞。但是，由于免疫監(jiān)視功能的存在，這些癌細胞可被人體中的各種抗 體和免疫細胞及時清除。本發(fā)明正是基于免疫監(jiān)視功能的原理，建立篩查存在正常人體內(nèi) 的天然抗癌抗體技術(shù)，為進一步發(fā)展癌癥防治方法和預(yù)測腫瘤發(fā)病風險奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，健康人體內(nèi)會自然形成與前述HER2、VEGFR1、MUCl和ABCC3四種 癌細胞特異性蛋白的抗原表位序列相對應(yīng)的特異性抗體，并單獨或與免疫細胞協(xié)同作用抑 殺癌細胞。本發(fā)明中將這類人體內(nèi)自然形成的、能識別其中一種或多種癌細胞特異性蛋白 的抗原表位的抗癌抗體統(tǒng)稱為"天然多克隆抗癌抗體"（natural polyclonal anti-cancer antibody, NPAA)。人血漿中NPAA可以認為是一類天然抗腫瘤抗體，在人體內(nèi)執(zhí)行免疫監(jiān)視 和免疫清除功能，防止腫瘤的形成與發(fā)展。
[0010] 因此，本發(fā)明的主要目的是提供一組用于檢測健康人血漿中NPAA濃度的線性抗 原多肽和由此制備的試劑盒，以及使用該組抗原多肽或該試劑盒檢測人血漿中NPAA的方 法。所述抗原多肽為HER2、VEGFR1、MUC1和ABCC3四種癌細胞特異性蛋白的抗原表位。這 些抗原表位能夠與人血漿中針對HER2、VEGFRl、MUCl和ABCC3的特異性抗體結(jié)合。
[0011] 如本發(fā)明所定義的"天然多克隆抗癌抗體（NPAA) "是天然存在于健康人體內(nèi)的，能 識別一種或多種癌細胞特異性蛋白抗原表位的抗體或多克隆抗體混合物，或者說優(yōu)選能識 別HER2、VEGFRl、MUCl和ABCC3四種癌細胞特異性蛋白抗原表位的一種或多種抗體或多克 隆抗體混合物。在本發(fā)明的特定實施方案中，所述NPAA是指能識別SEQ ID NO: 1-4中的一 個或多個表位序列的抗體或多克隆抗體混合物。
[0012] 本發(fā)明人利用免疫信息學方法和計算機軟件，在HER2、VEGFR1、MUC1和ABCC3蛋白 序列上進行人類白細胞二類抗原（Human leukocyte antigen II，HLA-II)表位制圖，彌別 具有高度親和力的序列，進而設(shè)計能被絕大多數(shù)人類抗原提呈細胞識別的HLA-II限制性 表位及線性抗原多肽。
[0013] 已經(jīng)公認，抗原抗體的結(jié)合主要發(fā)生在抗原決定簇與抗體結(jié)合位點之間。因此，兩 者在空間結(jié)構(gòu)和構(gòu)型上越接近完全互補，抗原抗體的結(jié)合就越穩(wěn)定，特異性就越強，結(jié)合效 率就越高，因此，目標抗體（待檢測抗體）及其結(jié)合位點結(jié)構(gòu)是先決因素，抗原決定簇影響 整個蛋白抗原與抗體結(jié)合狀態(tài)和親和特性。
[0014] 本發(fā)明根據(jù)HER2、VEGFR1、MUC1和ABCC3四種蛋白的生物學特性，針對這四種蛋白 的多個表位進行免疫信息學預(yù)測和模擬，經(jīng)分析與抗原性相關(guān)的各種參數(shù)，分別設(shè)計了四 種在空間結(jié)構(gòu)和構(gòu)型上與目標抗體完全互補的線性抗原多肽，其氨基酸序列見表1。
[0015] 表1.檢測人血漿中NPAA的線性抗原多肽序列
[0016]
【主權(quán)項】
1. 一種用于檢測NPAA抗體的組合物，其包括如下4種抗原多肽： H-LCRWGLLLALLPPGAASTQVCTGTDMKLRLPASP-OH ； H-GEDLKLSCTVNKFLYRDVTffILLRTVNNRTMHYSI-OH ； H-VQLTLAFREGTINVDVETQFNQYKTEAASRYNLTISD-OH ； H-LLYVGQSAAAIGANVWLSAWTNDAMADSRQNNTSL-OHo
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于：所述組合物中各抗原多肽的比例為 1:1:1:1 (濃度比或體積比）。
3. 由權(quán)利要求1或2的組合物制成的試劑盒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的試劑盒，將4種抗原多肽混合液包被的馬來酰亞胺（Maleimide) 活化96孔微量檢測板干燥后，用非金屬醫(yī)用包裝材料真空密封包裝，制成試劑盒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的試劑盒，其中所述材料為玻璃或醫(yī)用塑料。
6. -種體外的、非診斷目的檢測個體血漿中的NPAA方法，其包括使用權(quán)利要求1或2 所述的組合物或權(quán)利要求3-5任一項所述的試劑盒對個體血漿中的NPAA進行檢測。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，包括將所述4種抗原多肽等比混合，然后包被馬來酰亞胺 (Maleimide)活化的96孔微量檢測板，4度過夜孵育，洗板，再進行分步加樣分析。
8. 權(quán)利要求6所述的方法，其中所述分步加樣分析包括將待測血漿樣品雙復(fù)孔檢測， 同時設(shè)2個陰性對照孔和2個陽性對照孔；用分析液將血漿稀釋，并稀釋辣根過氧化物酶標 記的羊抗人IgG抗體，洗板，每孔加100 y 1 3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺（TMB)及過氧化物酶 混合液，室溫避光20?30分鐘，每孔添加50 y 1終止液10%硫酸溶液，然后用酶標儀檢測 光密度值，檢測波長為450nm，參考波長為630nm。
9. 權(quán)利要求1或2所述的組合物或權(quán)利要求3-5任一項所述的試劑盒在體外非診斷目 的檢測NPAA中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于檢測天然多克隆抗癌抗體(NPAA)的組合物、由該組合物制成的試劑盒、使用該組合物或該試劑盒檢測血漿中NPAA濃度的方法、以及該組合物或該試劑盒在檢測血漿NPAA中的應(yīng)用。本發(fā)明利用與目標NPAA完全互補的4種線性抗原多肽實現(xiàn)對血漿中NPAA的定性、定量檢測，可用于區(qū)分富含NPAA和不含NPAA的血漿。
【IPC分類】G01N21-31, G01N33-574
【公開號】CN104597241
【申請?zhí)枴緾N201510054670
【發(fā)明人】尉軍, 孟慶勇
【申請人】深圳市海蘭深生物醫(yī)學技術(shù)有限公司
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2015年1月30日