一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測定l-羥脯氨酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及內(nèi)標(biāo)法測定領(lǐng)域，尤其是涉及一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測定 L-羥脯氨酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] "皮革奶"是一種通過添加皮革水解蛋白從而提高蛋白質(zhì)含量檢測指標(biāo)的牛奶。皮 革水解蛋白中含有嚴(yán)重超標(biāo)的重金屬鉻等有害物質(zhì)，嚴(yán)重危害消費(fèi)者的身體健康甚至生命 安全。皮革水解蛋白也稱水解膠原蛋白，而L-羥脯氨酸是水解膠原蛋白特有的氨基酸，在 乳蛋白中則沒有（即水解膠原蛋白的水解產(chǎn)物含有L-羥脯氨酸）。因此，通過測定乳蛋白 水解樣品中的L-羥脯氨酸，就可以確定摻入的水解膠原蛋白或皮革水解蛋白的量。
[0003] 低含量L-羥脯氨酸的測定，可以提高水解膠原蛋白的檢出限。內(nèi)標(biāo)法在液相色 譜-串聯(lián)質(zhì)譜是一種較為準(zhǔn)確的定量分析技術(shù)。對于乳蛋白樣品的前處理較為復(fù)雜，包括 蛋白水解、樣品反復(fù)加水旋蒸除鹽酸等等，這時使用內(nèi)標(biāo)更為合適，可以校準(zhǔn)和消除由于樣 品前處理?xiàng)l件和檢測條件波動產(chǎn)生的影響，獲得較高的測量精度和準(zhǔn)確度。
[0004] 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法，以L-茶氨酸為內(nèi)標(biāo)，檢測蛋白水解物中的L-羥脯 氨酸（夏金根陳波姚守拙，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定膠原蛋白中的羥脯氨酸，色譜， 2008, 26 (5) : 595?598 ;趙善貞，鄧曉軍，彭濤等，親水性相互作用色譜-四極桿串聯(lián)線性離 子阱質(zhì)譜測定蛋白食品中L-羥脯氨酸殘留，分析化學(xué)，2011，39 (9) : 1373?1379)。L-茶 氨酸的結(jié)構(gòu)存在酰胺鍵（如下所示），構(gòu)成蛋白的肽鍵本質(zhì)上也是酰胺鍵，在酸中長時間水 解時，茶氨酸酰胺鍵和蛋白的肽鍵都同時水解。因此，酸水解使用茶氨酸為內(nèi)標(biāo)并不合適。 從結(jié)構(gòu)的看，4-羥基-哌啶-2-羧酸為六元環(huán)，L-羥脯氨酸為五元環(huán)，而L-茶氨酸為開鏈 式；前二者的只有一個氨基，都是環(huán)上的亞胺結(jié)構(gòu)，無酰胺，而L-茶氨酸有兩個氨基，都與 L-羥脯氨酸不同。因此，結(jié)構(gòu)上，4-羥基-哌啶-2-羧酸與L-羥脯氨酸相似程度遠(yuǎn)大于 L-茶氨酸。作為內(nèi)標(biāo)，相似程度越大，效果越好。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS)內(nèi)標(biāo)法測定L-羥脯氨酸的方法，其特征在于， 該方法以4-羥基-哌啶-2-羧酸為檢測內(nèi)標(biāo)，采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測定L-羥脯氨酸的方法，其 特征在于，該方法具體采用以下步驟： 1) 內(nèi)標(biāo)的配制：選用純度彡99. 0%的4-羥基-哌啶-2-羧酸，置于容量瓶中，加入乙 腈與水按體積比1 : 1?20配制得到的溶劑，溶解，定容，搖勻，4-羥基-哌啶-2-羧酸/ 溶劑為lg/L ; 2) 標(biāo)樣的配制：選用純度> 99. 0%的L-羥脯氨酸，置于容量瓶中，加入乙腈與水按體 積比1 : 1?20配制得到的溶劑，溶解，定容，搖勻，L-羥脯氨酸/溶劑為lg/L; 3) 水解用標(biāo)樣準(zhǔn)備：選用純度> 99. 0 %的4-羥基-哌啶-2-羧酸和L-羥脯氨酸，分 別置于容量瓶中，加濃度為4?12M的鹽酸，溶解，定容，搖勻，4-羥基-哌啶-2-羧酸濃度 和L-羥脯氨酸濃度都是為50mg/L ; 4) 樣品準(zhǔn)備：將待測的樣品蛋白置于封管中，加入水解用標(biāo)樣以及濃度為4?12M的 鹽酸，樣品蛋白與水解用標(biāo)樣、鹽酸的比例為：20?100mg : 1?10mL : 10?30mL，氮?dú)?置換，密封，水解； 5) 樣品前處理：步驟4)的樣品在溫度為90?120°C水解4?24小時，水解樣品真空 蒸餾除去鹽酸，pH = 5?7,置于容量瓶中，加入乙腈與水按體積比1 : 1配制得到的溶劑， 定容，搖勻，控制溶液中4-輕基-哌陡-2-羧酸/溶劑為0. 1?10mg/L ; 6) 用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法，利用內(nèi)標(biāo)和標(biāo)樣的確定含量獲得L-羥脯氨酸和 4-羥基-哌啶-2-羧酸的峰面積比和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，然后利用上述工作曲線測定、計(jì)算樣品 蛋白中L-羥脯氨酸含量。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測定L-羥脯氨酸的方法，其 特征在于，步驟6)具體采用以下步驟： 利用步驟1)和步驟2)的內(nèi)標(biāo)和標(biāo)樣配制7個樣品，樣品中4-羥基-哌啶-2-羧酸/ 溶劑為100mg/L，L-羥脯氨酸/溶劑為1?200mg/L ;用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定L-羥脯 氨酸與4-羥基-哌啶-2-羧酸的面積，以自變量（L-羥脯氨酸與4-羥基-哌啶-2-羧酸 的質(zhì)量比或質(zhì)量濃度比），和因變量L-羥脯氨酸與4-羥基-哌啶-2-羧酸的面積比）數(shù) 據(jù)，計(jì)算得到工作曲線y = 10. 12x+0. 00892 (y為L-輕脯氨酸與4-輕基-哌陡-2-羧酸的 面積比，x為L-羥脯氨酸與4-羥基-哌啶-2-羧酸的質(zhì)量比或質(zhì)量濃度比）； 利用液相色譜_串聯(lián)質(zhì)譜測定前處理的樣品，由保留時間確定L-羥脯氨酸和4-羥 基-哌啶-2-羧酸的面積比，通過工作曲線計(jì)算得到L-羥脯氨酸含量。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測定L-羥脯氨酸的方法， 液相色譜條件如下：色譜柱為Venusil Hilic柱（2. 1 X 150mm，5 y m，1〇〇 A )，預(yù)處 理柱為 Venusil Hilic Venusil Hilic 柱（2.1父1〇111111，511111，丨〇〇人）；流動相六為乙腈： 0.51111]1〇1/1^乙酸銨=9:1，口11 = 6.68;流動相13為乙腈：251111]1〇1/1^乙酸銨=6:4，口11 = 6. 67 ;梯度洗脫，流速為300 y L/min ;柱溫為30°C ;進(jìn)樣量為10 y L ; 質(zhì)譜條件如下：噴霧電壓為5000V ;鞘氣壓為172. 4kPa ;輔助氣壓為34. 5kPa ;毛細(xì) 管溫度為275°C ;第一對掃描離子為132. 1/86. 2,碰撞能量為15eV;第二對掃描離子為 146. 1/127. 2,碰撞能量為18eV;掃描模式為單離子檢測掃描（SRM)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測定L-羥脯氨酸的方法，液 相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定采用美國熱電公司制作的TSQQuantumAccess高效液相色譜-串 聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有噴霧電離源和大氣壓化學(xué)電離源。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測定L-羥脯氨酸的方 法，所述的樣品蛋白為乳蛋白。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測定L-羥脯氨酸的方 法，所述的樣品蛋白包括牛奶、羊奶、駱駝奶、人奶、豆奶或椰奶。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測定L-羥脯氨酸的方 法，所述的樣品蛋白為奶粉、煉乳、酸奶、奶油、奶酪、乳品飲料、蛋白粉、豆粉、奶糖、奶巧克 力或奶油巧克力。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)內(nèi)標(biāo)法測定乳品中L-羥脯氨酸的方法，以4-羥基-哌啶-2-羧酸為檢測內(nèi)標(biāo)，采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量?，F(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明定量限達(dá)到1mg/L，回收率80.2～116.5％，相對誤差(RSD)為4.2～12.6％。本方法對樣品前處理和測定的全過程，通過內(nèi)標(biāo)校正，有較高的測量精度和準(zhǔn)確度。
【IPC分類】G01N30-02
【公開號】CN104614452
【申請?zhí)枴緾N201410748715
【發(fā)明人】盧偉京, 盛立彥, 鐘佳琪, 李美華, 管方方, 孫雯, 陳保華, 徐仲杰
【申請人】上?；ぱ芯吭?br>【公開日】2015年5月13日
【申請日】2014年12月9日