一種大豆過氧化物酶標記化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒及使用方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大豆過氧化物酶標記化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒及使用方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]發(fā)光分析中的發(fā)光是指當一個分子的電子從激發(fā)態(tài)躍迀到基態(tài)時所發(fā)出的光，當基態(tài)分子吸收化學(xué)反應(yīng)釋放的能量躍迀到激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的分子以光輻射的形式返回基態(tài)時產(chǎn)生的光就稱為化學(xué)發(fā)光。基于化學(xué)發(fā)光強度(峰值強度或發(fā)光總量)和被測物含量之間的關(guān)系建立的分析方法稱為化學(xué)發(fā)光分析法，它具有靈敏度高，線性范圍寬，選擇性好，儀器設(shè)備簡單等特點，化學(xué)發(fā)光分析法憑其自身的優(yōu)勢在無機物、有機痕量和超痕量分析領(lǐng)域都得到了廣泛應(yīng)用。近年來，其分析領(lǐng)域擴展到如氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素、激素、生物堿和各類藥物等復(fù)雜有機物的檢測，化學(xué)發(fā)光分析法的發(fā)展為生命、環(huán)境、材料方面的科學(xué)研宄提供了高靈敏、高效的全新分析手段，推動了這方面科學(xué)理論和高新技術(shù)的發(fā)展。從標記免疫分析角度，化學(xué)發(fā)光酶免疫分析以酶標記生物活性物質(zhì)進行免疫分析，免疫復(fù)合物上的酶再作用于發(fā)光底物，根據(jù)測定的發(fā)光信號進行定量分析。目前，常用的酶標記物有辣根過氧化物酶。
[0003]辣根過氧化物酶是一個陽離子酶，當用它來催化魯米諾-過氧化氫反應(yīng)時，即使是在發(fā)光體系中加入增強劑對碘苯酚，僅僅是在開始的幾分鐘化學(xué)發(fā)光強度明顯增強，并且達到峰值，后來因HRP與底物氧化自由基產(chǎn)物相互作用而使酶的失活，導(dǎo)致化學(xué)發(fā)光強度迅速衰減。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是提供一種大豆過氧化物酶標記化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒及使用方法和應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0005]本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0006]一種大豆過氧化物酶標記化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒，包括前列腺特異性捕獲抗體包被的硝酸纖維素膜、大豆過氧化物酶標記的前列腺特異性抗體和大豆過氧化物酶所作用的發(fā)光底物液，其中，前列腺特異性捕獲抗體和大豆過氧化物酶標記的前列腺特異性抗體均可以同待測抗原特異性結(jié)合；硝酸纖維素膜單孔內(nèi)同時有3個以上包被前列腺特異性捕獲抗體的點。
[0007]進一步地，所述大豆過氧化物酶標記的前列腺特異性抗體采用改良過碘酸鈉法制備。
[0008]進一步地，所述改良過碘酸鈉法具體步驟如下:
[0009]步驟一、取Img大豆過氧化物酶溶于10yL PBS中，加入12mg/mL Na14溶液100 μ L，混勻，置室溫避光反應(yīng)15min ；
[0010]步驟二、取出步驟一得到的溶液，后加入100 μ L，1ν/ν%Ζ二醇室溫反應(yīng)30min ；[0011 ] 步驟三、向步驟二得到的溶液中加入575uL，lmg/mL前列腺特異性抗體，混勻，裝入透析袋，于50mM pH 9.6碳酸鹽緩沖液4°C透析24h，使大豆過氧化物酶和前列腺特異性抗體結(jié)合；
[0012]步驟四、向步驟三得到的溶液中加入5mg/mL NaBH4溶液80 μ L，混勾，置4°C還原反應(yīng)2h ；
[0013]步驟五、加入和步驟四得到的溶液等體積的飽和硫酸錢溶液，鹽析0.5h，1000rpm離心15min，去上清，沉淀以PBS溶解，裝入透析袋，于PBS中4°C透析過夜，重復(fù)步驟五操作兩次；
[0014]步驟六、次日取出離心，除去不溶物，上層清液為大豆過氧化物酶標記的前列腺特異性抗體，加PBS 500 μ L復(fù)溶；
[0015]步驟七、效價測定合格后，加入等量甘油，分裝小瓶保存。
[0016]進一步地，所述前列腺特異性捕獲抗體包被的硝酸纖維素膜的制備方法如下:
[0017]選用孔徑為0.45 μπι白色的硝酸纖維素膜，前列腺特異性捕獲抗體點樣緩沖液為0.1mM PBS，6wt%蔗糖和0.0Olwt %甲基紫染料的混合液，前列腺特異性捕獲抗體濃度為
0.25mg/mL，控制溫度22?24°C，濕度50%進行點樣，4°C包被過夜后，置于恒溫恒濕箱中干燥I?2h，最終在硝酸纖維素膜上的單孔內(nèi)同時有3個以上包被前列腺特異性捕獲抗體的點。
[0018]進一步地，所述大豆過氧化物酶所作用的發(fā)光底物液為1.2mM 3-(10r -吩噻嗪基)丙基-1-磺酸鹽(SPTZ)、0.6mM 4-嗎啉吡啶(MORPH)、0.4mM魯米諾、0.4mM H2O2以及50mM pH 8.5的Tris-HCl緩沖液組成的混合溶液。
[0019]上述大豆過氧化物酶標記化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的使用方法，包括如下步驟:
[0020]步驟一、封閉前列腺特異性捕獲抗體包被的硝酸纖維素膜的非特異性活性位點
[0021]用150 yL 5wt%牛血清白蛋白加入到前列腺特異性捕獲抗體包被的硝酸纖維素膜上，室溫封閉2h ；
[0022]步驟二、前列腺特異性捕獲抗體與待檢測抗原發(fā)生第一次免疫反應(yīng)
[0023]將100 μ L待檢測血清加入步驟一封閉好的硝酸纖維素膜上，同時設(shè)置陰性對照即加入的血清種不含待檢測物，陽性對照即血清中含有已知濃度待檢測抗原，室溫孵育30min，TTBS緩沖液震蕩洗滌四次，每次8min，轉(zhuǎn)速設(shè)置250rpm，最后拍干；
[0024]步驟三、大豆過氧化物酶標記的前列腺特異性抗體與待檢測抗原發(fā)生第二次免疫反應(yīng)
[0025]加入100 UL —定稀釋度的大豆過氧化物酶標記的前列腺特異性抗體于步驟二得到的硝酸纖維素膜上，室溫孵育30min，TTBS緩沖液震蕩洗滌四次，每次8min，轉(zhuǎn)速設(shè)置250rpm，最后拍干；
[0026]步驟四、大豆過氧化物酶所作用的發(fā)光底物液加入，發(fā)光信號檢測
[0027]在步驟三得到的硝酸纖維素膜上加入大豆過氧化物酶所作用的發(fā)光底物液，利用CCD成像立即采集各孔的化學(xué)發(fā)光信號。
[0028]上述大豆過氧化物酶標記化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒在血清檢測中的應(yīng)用。
[0029]本發(fā)明的有益效果:
[0030]1、本發(fā)明大豆過氧化物酶標記化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒，采用化學(xué)發(fā)光法檢測抗原，一方面，在單個檢測孔內(nèi)檢測同一個樣品可平行測定三次以上，實現(xiàn)了高通量的檢測，同時對樣品的需求量減少了，并有效降低了檢測時的區(qū)內(nèi)偏差，提高了檢測精密度。另一方面，采用化學(xué)發(fā)光的檢測方法，使得檢測靈敏度獲得大大提高。
[0031]2、本發(fā)明試劑盒采用大豆過氧化物酶作為標記酶，其為陰離子酶，不會因為氧化反應(yīng)產(chǎn)物作用失活，發(fā)光信號的衰退沒有辣根過氧化物酶迅速，即會產(chǎn)生一個較長時間的化學(xué)發(fā)光信號，具有更高的穩(wěn)定性。此外，大豆過氧化物酶是從大豆皮中提取出來的提取原料來源充足、價廉易得，有望用于商品化化學(xué)發(fā)光免疫檢測，以降低檢測成本。
[0032]3、本發(fā)明酶標記化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒中使用大豆過氧化物酶在發(fā)光系統(tǒng)中加入兩種增敏劑(MORPH和SPTZ)來增強發(fā)光信號，增敏后的發(fā)光強度在較長的時間內(nèi)保持穩(wěn)定，便于重復(fù)測量，從而提高分析靈敏度和準確性。
【附圖說明】
[0033]圖1是本發(fā)明大豆過氧化物酶標記化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒進行檢測抗原的流程不意圖。
【具體實施方式】
[0034]下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明做更進一步的解釋。下列實施例僅用于說明本發(fā)明，但并不用來限定本發(fā)明的實施范圍。
[0035]一種大豆過氧化物酶標記化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒，包括前列腺特異性捕獲抗體包被的硝酸纖維素膜、大豆過氧化物酶標記的前列腺特異性抗體和大豆過氧化物酶所作用的發(fā)光底物液，其中，前列腺特異性捕獲抗體和大豆過氧化物酶標記的前列腺特異性抗體均可以同待測抗原特異性結(jié)合；硝酸纖維素膜單孔內(nèi)同時有3個以上包被前列腺特異性捕獲抗體的點。標記酶除了大豆過氧化物酶，還可以是其它含有糖苷鍵的酶。捕獲抗體可以是針對不同待測抗原的多種捕獲抗體。
[0036]所述大豆過氧化物酶標記的前列腺特異性抗體采用改良過碘酸鈉法制備，具體步驟如下:
[0037]步驟一、取Img大豆過氧化物酶溶于100 μ L PBS中，加入12mg/mL似104溶液100 μ L，混勻，置室溫避光反應(yīng)15min ；
[0038]步驟二、取出步驟一得到的溶液，后加入100 μ L，1ν/ν%乙二醇室溫反應(yīng)30min ；
[0039]步驟三、向步驟二得到的溶液中加入575 μ L，lmg/mL前列腺特異性抗體，混勾，裝入透析袋，于50mM pH 9.6碳酸鹽緩沖液4°C透析24h，使大豆過氧化物酶和前列腺特異性抗體結(jié)合；
[0040]步驟四、向步驟三得到的溶液中加入5mg/mL NaBH4溶液80 μ L，混勾，置4°C還原反應(yīng)2h ；
[0041]步驟五、加入和步驟四得到的溶液等體積的飽和硫酸錢溶液，鹽析0.5h，1000rpm離心15min，去上清，沉淀以PBS溶解，裝入透析袋，于PBS中4°C透析過夜，重復(fù)步驟五操作兩次；
[0042]步驟六、次日取出離心，除去不溶物，上層清液為大豆過氧化物酶標記的前列腺特異性抗體，加PBS 500 μ L復(fù)溶；
[0043]步驟七、效價測定合格后，加入等量甘油，分裝小瓶保存。
[0044]所述前列腺特異性捕獲抗體包被的硝酸纖維素膜的制備方法如下:選用孔徑為
0.45μπι白色的硝酸纖維素膜，前列腺特異性捕獲抗體點樣緩沖液為0.1mM
糖和0.001wt%甲基紫染料的混合液，前列腺特異性捕獲抗體濃度為0.25mg/mL，控制溫度22?24°C，濕度50%進行點樣，4°C包被過夜后，置于恒溫恒濕箱中干燥I?2h，最終在硝酸纖維素膜上的單孔內(nèi)同時有3個以上包被前列腺特異性捕獲抗體的點。
[0045]所述大豆過氧化物酶所作用的發(fā)光底物液為1.2mM 3-(1(^ -吩噻嗪基)丙基-1-磺酸鹽、0.6mM 4-嗎啉吡啶、0.4mM魯米諾、0.4mM H2O2以及 50mM pH 8.5 的 Tris-HCl緩沖液組成的混合溶液。
[0046]上述大豆過氧化物酶標記化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的使用方法，如圖1所示，包括如下步驟:
[0047]步驟一、封閉前列腺特異性捕獲抗體包被的硝酸纖維素膜的非特異性活性位點<