一種檢測(cè)癌胚抗原的電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于電化學(xué)免疫傳感器技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)癌胚抗原的電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]癌胚抗原(CEA)是一個(gè)廣譜性腫瘤標(biāo)志物，它能向人們反映出多種腫瘤的存在，對(duì)大腸癌、乳腺癌和肺癌的療效判斷、病情發(fā)展、監(jiān)測(cè)和預(yù)后估計(jì)是一個(gè)較好的腫瘤標(biāo)志物。目前檢測(cè)CEA的免疫分析方法主要有放射性免疫測(cè)定法、酶聯(lián)免疫分析法、壓電免疫分析法、熒光免疫分析法等。雖然這些方法靈敏可靠，但是存在一些缺點(diǎn):有輻射危害、分析時(shí)間長(zhǎng)、需要復(fù)雜的電器儀表等。
[0003]近年來，電化學(xué)免疫傳感器受到了廣泛關(guān)注，這是由于它具有良好的可移植性、低耗費(fèi)、高的檢測(cè)靈敏度等內(nèi)在優(yōu)勢(shì)。在電化學(xué)免疫分析過程中，通常使用酶作信號(hào)探針，但是酶容易滅活、價(jià)格昂貴，因此，構(gòu)建無酶免疫傳感器引起了分析者們的注意。銀納米粒子對(duì)雙氧水的還原有高的催化活性，這一催化特性使銀納米粒子成為構(gòu)建無酶免疫傳感器的潛在材料。然而，單純銀納米材料的生物兼容性不好，因此需要制備具有高催化活性和好生物兼容性的材料來構(gòu)建無酶?jìng)鞲衅?。牛血清蛋白穩(wěn)定的銀納米粒子(AgOBSA)集合了銀納米粒子的催化活性和BSA的良好生物兼容性，在傳感器的構(gòu)建方面有很好的應(yīng)用前景。
[0004]石墨烯(GR)具有優(yōu)異的電化學(xué)穩(wěn)定性、高的導(dǎo)電性、大的比表面積，是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。此外，基于GR的復(fù)合材料綜合了不同材料各自的特性，也受到了人們的廣泛關(guān)注。因此，將GR和AgOBSA復(fù)合制得的材料不僅具有好的的導(dǎo)電性、高的催化性能、良好的生物兼容性，可以更好地應(yīng)用于抗體的固定。
[0005]本發(fā)明用電沉積的方法將金納米修飾到玻碳電極表面，然后依次固載一抗和抗原，用GR/Ag@BSA復(fù)合材料標(biāo)記二抗，制備了一種檢測(cè)CEA的電化學(xué)免疫傳感器，該傳感器具有尚的靈敏度、選擇性和穩(wěn)定性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)CEA的電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建方法，尤其是基于GR/Ag@BSA復(fù)合材料的檢測(cè)CEA的電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建方法。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)問題:
本發(fā)明的電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建方法包括如下步驟:
(O電化學(xué)沉積金納米粒子修飾的玻碳電極；
(2)聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)功能化還原石墨烯(GR)的制備；
(3)牛血清蛋白(BSA)穩(wěn)定銀納米粒子的制備；
(4)牛血清蛋白保護(hù)銀納米粒子與功能化還原石墨稀復(fù)合材料(GR/Ag@BSA)的制備；
(5)GR/Ag@BSA標(biāo)記癌胚抗原第二抗體(GR/Ag@BSA-Ab2)的制備；
(6)利用夾心免疫法構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器。
[0008]所述步驟(I)電化學(xué)沉積金納米粒子修飾的玻碳電極，具體包括以下步驟:
a依次用1.0，0.3和0.5 μ m的三氧化二鋁拋光粉拋光處理玻碳電極，然后用超純水沖洗干凈，自然晾干；
b將處理清潔的玻碳電極浸入3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的氯金酸溶液中，用玻碳電極為工作電極，鉑絲電極為對(duì)電極，銀/氯化銀電極為參比電極，在室溫下，以-0.2 V的工作電位恒電位沉積30 s制備金納米粒子修飾的玻碳電極，超純水清洗干凈，晾干。
[0009]所述步驟(2) PDDA功能化GR的制備，具體包括以下步驟:
a氧化石墨烯的制備:稱量0.75 g石墨粉加入到100 mL體積比為1:9的磷酸和濃硫酸的混合溶液中，并在水浴鍋中加熱到30 0C，稱量4.5 g高錳酸鉀加入到上述混合液中，升溫至50 °C，磁力攪拌反應(yīng)12 h后，將樣品倒入預(yù)先加入4 mL雙氧水的300 mL冰水中，得到的混合溶液10000轉(zhuǎn)離心分離15 min，用超純水洗滌7次，在真空干燥箱中60 °C干燥12 h后得到固體氧化石墨烯；
b GR的制備:稱取25 mg步驟(2) a制得的氧化石墨稀固體溶解到150 mL超純水中，超聲波處理30 min，依次向溶液中加入100 yL水合肼，560 μ L氨水，10 mg聚乙烯吡咯烷酮，在90 °C反應(yīng)I h，得到的混合溶液10000轉(zhuǎn)離心分離15 min，用超純水洗滌5次，在真空干燥箱中60 °C干燥12 h后得到固體GR ；
c PDDA功能化GR的制備:稱取2.5 mg步驟(2)b制得的GR固體溶于5 mL超純水中，超聲波處理30 min，向溶液中加入10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的TODA，室溫下攪拌2 h，得到的混合溶液10000轉(zhuǎn)離心分離10 min，用超純水洗滌3次后重新溶解到5 mL超純水中，成功制得I3DDA-GR溶液。
[0010]所述步驟(3)牛血清蛋白(BSA)穩(wěn)定銀納米粒子的制備，具體包括以下步驟:
將45 mg BSA溶解到10 mL超純水中，室溫下攪拌5 min后，加熱至60 °C，迅速向溶液中加入10 mL 8 mmol/L的硝酸銀，繼續(xù)攪拌45 min，得到的混合溶液10000轉(zhuǎn)離心分離
5min,用超純水洗滌5次，室溫下干燥后得到固體AgOBSA。
[0011]所述步驟(4)牛血清蛋白保護(hù)銀納米粒子與功能化還原石墨稀復(fù)合材料(GR/Ag@BSA)的制備，具體包括以下步驟:
稱取I mg步驟(3)制備的AgOBSA溶解到I mL超純水中，攪拌5 min后和I mL步驟
(2)制備的TODA-GR溶液混合，室溫下攪拌4 h，將得到的混合液1000轉(zhuǎn)離心分離5 min,棄去上清液，溶解到I mL pH 7.4的PBS緩沖溶液中制得GR/Ag@BSA溶液。
[0012]所述步驟(5)制備GR/Ag@BSA標(biāo)記的Ab2,具體包括以下步驟:
a將步驟(4)制備的I mL GR/Ag@BSA溶液與3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛溶液混合，室溫下攪拌2 h，得到的混合液10000轉(zhuǎn)離心分離5 min，棄去上清液，溶解到I mL pH
7.4的PBS緩沖溶液中；
b將I mL 20 μ g/mL的Ab2加入上述溶液中攪拌孵育2 h，10000轉(zhuǎn)離心分離5 min,棄去上清液，重新溶解到I mL pH 7.4的PBS緩沖溶液中，得到GR/Ag@BSA_Ab2溶液。
[0013]所述步驟(6)構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器，具體包括以下步驟:
a滴涂5 μ L I mg/mL的CEA第一抗體至上述步驟(I)制備的金納米粒子修飾的玻碳電極表面，室溫下孵育I h，pH 7.4的PBS緩沖溶液清洗3次，晾干；
b在上述電極表面滴加5 μ L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的BSA溶液以封閉電極表面的非特異性活性位點(diǎn)，pH 7.4的PBS緩沖溶液清洗3次，晾干；
c將5 μ L 0.005-150 ng/mL的CEA抗原溶液分別滴涂到不同電極表面，室溫下孵育40 min, pH 7.4的PBS緩沖溶液清洗3次，晾干；
d將5 uL GR/Ag@BSA-Ab2滴到電極表面，室溫下孵育40 min, pH 7.4的PBS緩沖溶液清洗3次，晾干，即得到電化學(xué)免疫傳感器的工作電極；
e將銀/氯化銀參比電極、鉑絲對(duì)電極和上述制備的工作電極連接在電化學(xué)工作站上;
f pH 7.4的PBS緩沖溶液作為底液，通過計(jì)時(shí)電流法檢測(cè)工作電極對(duì)雙氧水的響應(yīng)，根據(jù)所得的電流值與CEA濃度的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，繪制工作曲線。
【附圖說明】
[0014]圖1是本發(fā)明的電化學(xué)免疫傳感器對(duì)CEA測(cè)定的工作曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0015]以下通過具體實(shí)施例來說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此。
[0016]實(shí)施例1制備檢測(cè)CEA標(biāo)準(zhǔn)樣品的電化學(xué)免疫傳感器。
[0017]步驟1.制備I3DDA功能化的GR
a氧化石墨烯的制備:將100 mL體積比為1:9的磷酸和濃硫酸混合溶液加入到三口瓶中，然后稱取0.75 g石墨粉加入到上述溶液中，加熱到30 °C，向溶液中加入4.5 g高錳酸鉀后，調(diào)節(jié)水浴鍋溫度到50 °C，磁力攪拌條件下反應(yīng)12 h，反應(yīng)停止后，將樣品倒入預(yù)先加入了 4 mL雙氧水的300 mL冰水中，充分?jǐn)嚢?，得到的混合液?jīng)離心分離，用超純水洗滌7次，隨后在真空干燥箱中60 °C干燥，干燥后得到棕黃色氧化石墨烯固體；
b GR的制備:將25 mg上述步驟a制備的氧化石墨稀溶解到150 mL超純水中，超聲波處理30 min，依次向溶液中加100 μ L水合肼，560 μ L氨水，10 mg聚乙烯吡咯烷酮，水浴鍋中90 °C反應(yīng)I h，得到的混合液離心分離，用超純水洗滌5次，棄去上清液，在真空干燥箱中60 °C干燥，干燥后得到黑色GR固體；
c PDDA功能化GR的制備:稱取2.5 mg上述步驟b制備的GR加入到5 mL超純水中，超聲波處理30 min,將預(yù)先配好的10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的TODA加入到上述溶液中，室溫下攪拌2 h，得到的混合液經(jīng)離心分離，用超純水洗滌3次，棄去上清液，重新溶解到5 mL超純水中，成功制得I3DDA-GR溶液。
[0018]步驟2.AgiBSA的制備:將45 mg BSA固體粉末溶解到10 mL超純水中，室溫下攪拌5 min，在水浴鍋中加熱到60 °C，迅速加入10 mL 8 mmol/L的硝酸銀溶液，繼續(xù)在60 °C下攪拌45 min，得到的混合溶液經(jīng)離心分離，用超純水洗滌5次，棄去上清液，在室溫下干燥，得到固體AgOBSA。
[0019]步驟3.GR/AgiBSA復(fù)合材料的制備:將I mg步驟2制得的AgOBSA溶解到I mL超純水中，充分?jǐn)嚢? min,向溶液中加入I mL步驟I制得的TODA-GR，繼續(xù)在室溫下攪拌
4h，得到的混合液經(jīng)離心分離，棄去上層清液，得到的混合物溶解到I mL pH 7.4的PBS緩沖溶液中，得到GR/Ag@BSA溶液。
[0020]步驟4.GR/AgiBSA標(biāo)記第二抗體溶液的制備:將步驟3制得的I mL GR/AgiBSA溶液與3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛溶液混合，室溫下攪拌2 h，得到的混合溶液離心分離，棄去上清液，溶解到I mL pH 7.4的PBS緩沖溶液中；將I mL 20 μ g/mL的Ab2加入上述溶液中，室溫下攪拌孵育2 h，離心分離，棄去上層清液，重新溶解到I mL pH 7.4的PBS緩沖溶液中，即得到溶液。
[0021]步驟5.金納米粒子修飾玻碳電極的制備:依次用1.0,0.3和0.5 μm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理玻碳電極，然后用超純水沖洗，自然晾干；將處理清潔的玻碳電極浸入
3mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的氯金酸溶液中，用玻碳電極為工作電極，鉑絲電極為對(duì)電極，銀/氯化銀電極為參比電極，在室溫下，以-0.2 V的工作電位恒電位沉積30 s制備金納米粒子修飾的玻碳電極，超純水清洗，晾干。
[0022]步驟6.滴涂5 μ L I mg/mL的CEA第一抗體至步驟5制得的金納米粒子修飾的玻碳電極表面，室溫下孵育I h，超純水清洗，晾干。
[0023]步驟7.將5 UL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的BSA溶液滴涂至步驟6制得的電極表面，用于封閉電極的非特異性活性位點(diǎn)，用PH 7.4的PBS緩沖溶液溶液對(duì)電極清洗，晾干。
[0024]步驟8.將5 μ L 0.005-150 ng/mL的CEA抗原溶液分別滴涂到BSA掩蔽的不同電極表面，室溫下孵育40 min, pH 7.4的PBS緩沖溶液