用于快速可逆生物分子標(biāo)記的組合物和方法
【專利說明】用于快速可逆生物分子標(biāo)記的組合物和方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于將樣品中的生物祀標(biāo)與其標(biāo)記快速分離的方法和組合物。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的許多不同應(yīng)用需要對生物祀標(biāo)（諸如分子、DNA、蛋白質(zhì) 或細(xì)胞）進(jìn)行特異性標(biāo)記。標(biāo)記提供使用標(biāo)記的新的功能或物理特性（英光、磁性、密度、 酶活性、放射性等）對來自復(fù)雜生物樣品內(nèi)的祀標(biāo)進(jìn)行檢測或操縱的靈敏方法。例如，英光 標(biāo)記能夠使生物祀標(biāo)（在某些情況下W分子靈敏的程度）可視化。英光技術(shù)正在革新從研 究工作臺(tái)到臨床的許多生物學(xué)領(lǐng)域。同樣地，磁性標(biāo)記能夠?qū)崿F(xiàn)使用磁共振成像（MRI)或 醫(yī)學(xué)顆粒成像（MPI)技術(shù)（均為當(dāng)前重要的臨床診斷手段）對生物祀標(biāo)進(jìn)行成像。磁性標(biāo) 記的另一個(gè)重要應(yīng)用是用于使用磁場從復(fù)雜樣品中分離和純化生物祀標(biāo)（主要是DNA、蛋 白質(zhì)或細(xì)胞）。
[0004] 磁性標(biāo)記和分離已被廣泛應(yīng)用，并革新了細(xì)胞分離領(lǐng)域。細(xì)胞分離涉及在細(xì)胞物 理或功能特性基礎(chǔ)上從復(fù)雜生物樣品（血液、組織、骨等）中分離特定細(xì)胞類型。英光激活 細(xì)胞分選（FAC巧是一種在用英光抗體標(biāo)記后細(xì)胞受體表達(dá)的基礎(chǔ)上分離所述細(xì)胞的流式 細(xì)胞術(shù)形式。然而，F(xiàn)ACS的缺點(diǎn)是分離費(fèi)時(shí)且產(chǎn)量低。對于磁性分離，通常利用蛋白質(zhì)或 抗體的親和結(jié)合特性（通常稱為免疫標(biāo)記的方法）使磁性微?；蚣{米顆粒祀向細(xì)胞受體。 綴合到抗體或蛋白質(zhì)的磁性微?；蚣{米顆粒用于選擇性地祀向復(fù)雜的生物樣品內(nèi)的細(xì)胞。 陽性選擇是所需細(xì)胞類型被顆粒直接標(biāo)記并通過磁性洗涂分離的常用方法。相反，對于陰 性選擇（或貧化/富集），不需要的細(xì)胞類型被顆粒標(biāo)記并通過施加磁場而去除，W未標(biāo)記 的形式分離所需細(xì)胞。陽性選擇的優(yōu)點(diǎn)是分離的細(xì)胞通常比陰性選擇的純度更高，但缺點(diǎn) 是它們具有結(jié)合到其表面上的顆粒。陰性選擇使得所需細(xì)胞保持未被標(biāo)記，但缺點(diǎn)是純度 通常比陽性選擇更低，并且需要混合多個(gè)抗體W標(biāo)記不想要的細(xì)胞。陽性和陰性免疫磁性 細(xì)胞分離策略是目前眾多商用產(chǎn)品支持的完善技術(shù)。該些產(chǎn)品通常采用綴合到一級或二次 抗體、綴合到鏈霉親和素W與生物素化的抗體一起使用或綴合到葡聚糖W與四聚體抗體復(fù) 合物（TAC) -起使用的磁性顆粒。
[0005] 細(xì)胞分離領(lǐng)域目前要求更快還更復(fù)雜的策略W從相同樣品中分離多種細(xì)胞類型、 W分離不容易由其受體表達(dá)定義的細(xì)胞亞群，并且要求改進(jìn)的策略用于分離非常罕見的細(xì) 胞類型，在所有該些的同時(shí)保持細(xì)胞天然或接近天然狀態(tài)。對于免疫磁性技術(shù)，分離多種細(xì) 胞類型或不由單一受體表達(dá)定義的細(xì)胞類型的方法是采用陽性或陰性選擇和正交標(biāo)記技 術(shù)的組合。大多數(shù)連續(xù)分離應(yīng)用，特別是涉及多個(gè)陽性選擇或陽性選擇隨后陰性選擇的那 些應(yīng)用，要求在第一輪分離后從細(xì)胞表面有效去除磁性標(biāo)記，而不損害細(xì)胞的活力或回收 率（產(chǎn)率）。即使對于簡單的陽性選擇，非常需要W去除顆粒的方式來減輕顆粒對細(xì)胞的功 能或活力的干擾。已知的是微?；蚣{米顆粒可W通過不同的方法內(nèi)化到細(xì)胞中，該取決于 顆粒表面的物理和化學(xué)特性W及具體的細(xì)胞類型（Verma and Stellacci 2010)。除了細(xì)胞 功能，細(xì)胞表面上的顆?？筛蓴_許多下游測定。例如，在流式細(xì)胞術(shù)分析過程中，當(dāng)顆粒存 在時(shí)細(xì)胞的粒度測量（側(cè)向散射）向較大的值偏移，該使識(shí)別特定細(xì)胞群變得復(fù)雜。在細(xì) 胞表面上具有顆粒的另一缺點(diǎn)是，氧化鐵可w渾滅英光信號(hào)，從而降低了在分離的細(xì)胞上 進(jìn)行免疫英光測定的靈敏度。從臨床前和臨床觀點(diǎn)來看，如果要將分離的細(xì)胞用于包括細(xì) 胞治療應(yīng)用的人類研究中，那么重要的是細(xì)胞呈其天然或接近天然形式、不含雜質(zhì)和顆粒、 具有高功能性和活性。
[0006] 溫和地從細(xì)胞表面去除顆粒仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)槊庖呒?xì)胞分離領(lǐng)域的技術(shù)人員 知道，高親和力抗體/抗原或蛋白質(zhì)相互作用（Kd?1-lOOnM)需要將顆粒和細(xì)胞連接一起。 此類高親和力相互作用能夠在若干輪磁性洗涂下W高純度和產(chǎn)率分離細(xì)胞，但通常僅在對 細(xì)胞有破壞性的溶液條件下逆轉(zhuǎn)。在過去的20年中，已經(jīng)提出許多不同方法W從細(xì)胞中去 除顆粒，但許多方法損傷細(xì)胞、降低活力、改變功能特性或者它們過于復(fù)雜和費(fèi)時(shí)。
[0007] 該些策略中的一些包括將細(xì)胞在培養(yǎng)基中過夜溫育、改變抑、溫度、鹽、加入還原 劑來裂解抗體，或使用機(jī)械剪切力來破壞來自細(xì)胞表面的顆粒。
[0008] 美國專利號(hào)5, 081，030描述了使用消化酶如木瓜蛋白酶從細(xì)胞去除顆粒的方法。 同樣，歐洲專利號(hào)EP0819250B1描述了使用糖巧酶來釋放顆粒的方法。一旦抗體綴合的顆 粒已經(jīng)祀向細(xì)胞并且細(xì)胞被磁性純化，則將酶加至細(xì)胞息液中W消化參與顆粒細(xì)胞連接的 蛋白質(zhì)、抗體或多糖。此方法的缺點(diǎn)是，酶的成本高昂，它們在儲(chǔ)存過程中容易分解，所述方 法是費(fèi)時(shí)的，而且某些酶通過消化細(xì)胞表面蛋白而改變細(xì)胞功能。
[0009] Werther等（Werther, Normark等2000)描述了鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)與裂解 DNA接頭的聯(lián)合使用。為去除來自選定細(xì)胞的顆粒，將息浮液用面ase酶溫育。此構(gòu)思是 來自Dynal的磁性細(xì)胞分離的CE化ection產(chǎn)品線的基礎(chǔ)。所述方法的優(yōu)點(diǎn)在于，所述酶對 DNA接頭具有特異性，但它具有先前提到的基于酶的系統(tǒng)的缺點(diǎn)。
[0010] 美國專利號(hào)5, 429, 927描述了使用二次抗體來破壞抗體綴合的顆粒與其細(xì)胞表 面的受體的相互作用W從細(xì)胞去除顆粒的方法。在一種形式中，所述二次抗體是直接與 一次抗體結(jié)合從而誘導(dǎo)構(gòu)象改變并釋放所述顆粒的多克隆抗Fab。此方法是來自Dynal 的DETACHa邸AD顆粒去除系統(tǒng)的基礎(chǔ)，并且也已被Rasmussen等（Rasmussen, Smeland等 1992)和Geretti等（Geretti,Van Els等1993)描述。此方法的缺點(diǎn)是，它對于最終使用 者是費(fèi)時(shí)的（?45-60分鐘方法），對于高效顆粒釋放要求高濃度的二次抗體，并且根據(jù)一 次抗體的克隆和種類需要獨(dú)特的二次抗體。
[0011] 美國專利號(hào)5, 773, 224描述了肝素/抗凝血酶HI用于W列形式的陽性選擇和細(xì) 胞洗脫。所述方法使用與肝素綴合的固相柱，裝載生物素化的抗凝血酶III，并隨后通過抗 生物素蛋白交聯(lián)。使用所需細(xì)胞類型的一次抗體和生物素化的二次抗體來選擇細(xì)胞。通過 增加固相細(xì)胞相互作用的抗體親抗原性（avidity)的抗生物素蛋白交聯(lián)來提高抗凝血酶 III對于肝素的中等親和力。當(dāng)在分離結(jié)束加入游離的可溶性肝素時(shí)，它競爭抗凝血酶III 結(jié)合位點(diǎn)并從柱釋放細(xì)胞。逆轉(zhuǎn)是有效的，因?yàn)閱蝹€(gè)肝素/抗凝血酶III相互作用弱到足 W被直接競爭破壞。所述方法的缺點(diǎn)是，需要交聯(lián)劑來提高標(biāo)記的性能，因?yàn)樗辜?xì)胞分離 過程變得復(fù)雜。另一個(gè)缺點(diǎn)是，此方法限于肝素/抗凝血酶III，因?yàn)楦嗡厥茄褐谐Ｒ姷?抗凝血?jiǎng)?，所述方法不包括處理該些類型的樣品?br>[0012] 美國專利號(hào)5, 985, 658描述了使用巧調(diào)蛋白和巧調(diào)蛋白結(jié)合膚之間的可逆相互 作用從細(xì)胞中去除顆粒的方法。將細(xì)胞用所需細(xì)胞類型的一次抗體、隨后用膚綴合的二次 抗體和巧調(diào)蛋白綴合的顆粒標(biāo)記。蛋白和膚通過巧離子橋結(jié)合。顆粒去除通過加入去除離 子并逆轉(zhuǎn)結(jié)合的EGTA馨合劑而觸發(fā)。
[0013] 美國專利號(hào)6, 017, 719描述了使用工程化的膚來置換來自細(xì)胞表面的抗體綴合 的磁性顆粒的方法。膚結(jié)合至祀向抗體，并且通過競爭結(jié)合位點(diǎn)或引起抗體構(gòu)象變化而從 細(xì)胞表面置換它們。所述方法的主要缺點(diǎn)是必須合理設(shè)計(jì)并選擇用于將顆粒祀向細(xì)胞的每 個(gè)抗體的獨(dú)特的膚。
[0014] 生物素和鏈霉親和素或抗生物素蛋白具有極高的親和力（?fM)，并且通過生物 素化的抗體和鏈霉親和素或抗生物素蛋白綴合的顆粒方式已被廣泛用于細(xì)胞分離。鑒于其 高親和力，所述相互作用通常僅在蛋白變性和細(xì)胞破壞的條件下是可逆的。美國專利申請 2008/0255004描述了重組修飾的鏈霉親和素和修飾的生物素（脫硫生物素）的用途，其與 天然鏈霉親和素/生物素相比共同具有顯著降低的親和力。通過加入置換較低親和力脫硫 生物素的天然生物素來逆轉(zhuǎn)該種相互作用。為使細(xì)胞分離，使脫硫生物素與一次抗體綴合 并且使磁性顆粒與突變形式的鏈霉親和素綴合。此方法現(xiàn)在是來自Dynal的磁性細(xì)胞分離 的FlowComp產(chǎn)品線的基礎(chǔ)。此方法的一個(gè)限制是，與脫硫生物素綴合的抗體不能廣泛用于 許多細(xì)胞類型，并且需要由最終使用者來制備。
[0015] 美國專利號(hào)7, 776, 562和WIP0專利申請W02013/011011還描述了重組工程系統(tǒng) 用于可逆磁性細(xì)胞分離（和/或英光標(biāo)記）的用途。此方法是基于抗原特異性MHC分子或 表達(dá)融合膚諸如streptag的F油片段的弱親和力。Streptag結(jié)合streptactin，一種保留 其對生物素特異性的鏈霉親和素的突變形式。當(dāng)streptactin綴合的磁性顆粒裝載MHC分 子或Fab片段時(shí)，在顆粒-細(xì)胞相互作用中有足夠的抗體親抗原性W能夠特異性祀向和分 離所需細(xì)胞類型。在分離結(jié)束時(shí)加入游離的可溶性生物素從streptag置換streptactin并 釋放顆粒。在細(xì)胞表面上弱結(jié)合的血1C分子或Fab片段也被去除，因?yàn)殡S著顆粒釋放抗體 親抗原性喪失。此方法具有對于每個(gè)不同細(xì)胞類型都需要融合至streptag的重組抗體的 主要缺點(diǎn)，并且如美國專利號(hào)5, 773, 224,需要另外的交聯(lián)劑W增加結(jié)合伴侶的親合性（抗 體親抗原性）。此構(gòu)思現(xiàn)在是由IBA GmbH提供的Streptamer磁性細(xì)胞分離試劑的基礎(chǔ)。
[0016] 在免疫磁性細(xì)胞分離中用于可逆標(biāo)記的該些方法的發(fā)展已經(jīng)朝著對細(xì)胞更溫和 但增加了標(biāo)記試劑（重組工程化的蛋白質(zhì)/抗體、交聯(lián)劑）和細(xì)胞分離方法（許多標(biāo)記步 驟、長持續(xù)時(shí)間）的復(fù)雜性的方法進(jìn)行。因此，仍然存在對于改進(jìn)的可逆標(biāo)記技術(shù)的重要需 求，其更快、使用更簡單的試劑并且在不同細(xì)胞類型和種類之間廣泛起作用。在細(xì)胞分離領(lǐng) 域，改進(jìn)的方法和組合物在臨床前、臨床和細(xì)胞治療市場是需要的，并且用于要求呈接近天 然形式的高功能和活力細(xì)胞（包括通過連續(xù)分離而分離的特定細(xì)胞亞群）的基礎(chǔ)研究應(yīng) 用。在細(xì)胞分離領(lǐng)域W外，快速可逆標(biāo)記對于許多應(yīng)用（包括基于分子、DNA和蛋白質(zhì)的純 化、生物樣品的英光成像）是需要的。
[0017] 考慮到隨著醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)應(yīng)用，對于改進(jìn)的可逆標(biāo)記系統(tǒng)的理想要求包括；1) 標(biāo)記與其生物祀標(biāo)（細(xì)胞受體的顆粒）的高親和性結(jié)合，2)使用溫和釋放試劑（對細(xì)胞溫 和）快速和高效去除標(biāo)記（顆粒），3)對不同祀標(biāo)（包括細(xì)胞類型和種類）和應(yīng)用（包括 英光）的廣泛適用性，4)與正交標(biāo)記（用于連續(xù)或同時(shí)分離）兼容，5)可獲得的、廉價(jià)的和 穩(wěn)定的試劑W及6)容易進(jìn)行自動(dòng)化（簡單和快速過程）。
[001引發(fā)明概述
[0019] 本發(fā)明提供了用于實(shí)現(xiàn)在生理?xiàng)l件下快速可逆的低抗體親抗原性、高親和力和高 特異性的生物分子相互作用的組合物和方法。所述方法包括使生物祀標(biāo)（諸如分子、蛋白 質(zhì)、DNA、細(xì)胞等）與聚合物和抗聚合物配體連接W及使用生理上相容的聚合化合物來逆轉(zhuǎn) 它們結(jié)合的方法。所述方法還包括對用于正交標(biāo)記的不同聚合物/抗聚合物系統(tǒng)進(jìn)行組合 的方法。所述組合物包含包括與聚合物綴合的顆粒（英光、磁性、致密等）的標(biāo)記或與抗聚 合物抗體綴合的標(biāo)記。所述組合物還包含與所述聚合物綴合的生物分子（蛋白質(zhì)、抗體、 DNA等）。該些方法和組合物展示出對現(xiàn)有技術(shù)的重大改進(jìn)。它們特別可用于使用顆粒來 分離和隔離生物祀標(biāo)，對包括英光成像在內(nèi)的其它領(lǐng)域具有重要應(yīng)用。
[0020] 因此，本發(fā)明提供一種將樣品中的生物祀標(biāo)與標(biāo)記分離的方法，其包括：
[0021] 1)通過連接系統(tǒng)使所述生物祀標(biāo)與所述標(biāo)記結(jié)合，所述連接系統(tǒng)包含第一聚合物 和與所述第一聚合物結(jié)合的配體；和
[0022] 2)向所述樣品中加入第二聚合物W將所述生物祀標(biāo)與所述標(biāo)記分離。
[0023] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種將樣品中的生物祀標(biāo)與標(biāo)記分離的方法，其 包括：
[0024] 1)使用連接系統(tǒng)使所述生物祀標(biāo)與所述標(biāo)記結(jié)合，所述連接系統(tǒng)包含與連接至與 第一聚合物結(jié)合的配體的生物祀標(biāo)結(jié)合的配體和與所述第一聚合物綴合的標(biāo)記；和
[00巧]2)向所述樣品中加入第二聚合物W將所述生物祀標(biāo)與所述標(biāo)記分離。
[0026] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種將樣品中的生物祀標(biāo)與標(biāo)記分離的方法， 其包括：
[0027] 1)使用連接系統(tǒng)使生物祀標(biāo)與標(biāo)記結(jié)合，所述連接系統(tǒng)包含與連接至第一聚合物 的生物祀標(biāo)結(jié)合的配體和與結(jié)合到所述第一聚合物的配體綴合的標(biāo)記；和
[0028] 2)向所述樣品中加入第二聚合物W將所述生物祀標(biāo)與所述標(biāo)記分離。
[0029] 本發(fā)明還提供一種將生物祀標(biāo)和標(biāo)記分離的組合物，其包含：
[0030] 1)使所述生物祀標(biāo)與所述標(biāo)記結(jié)合的連接系統(tǒng)，其中所述連接系統(tǒng)包含第一聚合 物和與所述第一聚合物結(jié)合的配體；和
[0031] 2)可將所述生物祀標(biāo)與所述標(biāo)記分離的第二聚合物。
[0032] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供一種用于將生物祀標(biāo)和與第一聚合物綴合的標(biāo) 記分離的組合物，其包含：
[0033] 1)用于使所述生物祀標(biāo)與所述標(biāo)記結(jié)合的連接系統(tǒng)，所述連接系統(tǒng)包含與所述生 物祀標(biāo)結(jié)合的配體，所述生物祀標(biāo)連接至與綴合至所述標(biāo)記的聚合物結(jié)合的配體；和
[0034] 2)用于分離所述生物祀標(biāo)與所述標(biāo)記的第二聚合物。
[00巧]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供一種用于將生物祀標(biāo)和與結(jié)合到第一聚合物 的配體連接的標(biāo)記分離的組合物，其包含：
[0036] 1)用于使所述生物祀標(biāo)與所述標(biāo)記結(jié)合的連接系統(tǒng)，所述連接系統(tǒng)包含與所述生 物祀標(biāo)結(jié)合的配體，所述生物祀標(biāo)連接至與綴合至所述標(biāo)記的配體結(jié)合的第一聚合物；和
[0037] 2)用于分離所述生物祀標(biāo)與所述標(biāo)記的第二聚合物。
[0038] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)通過下列詳述將變得明顯。然而應(yīng)該理解，雖然詳述和 具體實(shí)施例示出本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但它們僅通過說明的方式給出，因?yàn)橥ㄟ^此詳述， 本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將變得明顯。
[0039] 附圖簡述
[0040] 圖1是應(yīng)用于可逆標(biāo)記細(xì)胞祀標(biāo)（或其它生物分子）的本發(fā)明的使用方法的示意 圖示。a)在此型式中，使諸如含有針對祀細(xì)胞受體的抗體和第一聚合物的雙特異性四聚體 抗體復(fù)合物（TAC)的連接配體與細(xì)胞和第一聚合物綴合的標(biāo)記一起溫育。b)在標(biāo)記和純 化或檢測后，通過加入游離的可溶性第二聚合物或衍生物來去除（釋放）聚合物綴合的標(biāo) 記?？上吹翎尫诺臉?biāo)記，并且可通過正交技術(shù)使祀細(xì)胞經(jīng)受進(jìn)一步（連續(xù)）的標(biāo)記或用于 下游測定和應(yīng)用中。不同類型的標(biāo)記尤其包括英光基團(tuán)（flourophore)、磁性顆粒、酶或同 位素。
[0041] 圖2是應(yīng)用于可逆標(biāo)記細(xì)胞祀標(biāo)（或其它生物分子）的本發(fā)明的使用方法的示意 圖示。a)在此型式中，使針對祀細(xì)胞受體的第一聚合物綴合的抗體與細(xì)胞和綴合至抗聚合 物抗體配體的標(biāo)記一起溫育。b)通過加入游離的可溶性第二聚合物或衍生物從祀細(xì)胞中去 除標(biāo)記。
[0042] 圖3顯示使用聚（己二醇）（PEG)和顆粒標(biāo)記作為實(shí)例來制備第一聚合物綴合的 標(biāo)記、配體綴合的標(biāo)記和第一聚合物綴合的配體的幾種化學(xué)物質(zhì)。a)具有表面琉基（SH) 基團(tuán)的標(biāo)記可W在一個(gè)步驟中綴合至含有琉基反應(yīng)性馬來醜亞胺基團(tuán)的PEG。具有表面胺 (畑2)基團(tuán)的標(biāo)記可W在一個(gè)步驟中綴合至含有胺反應(yīng)性N服(N-輕基玻巧醜亞胺）基團(tuán)的 PEG?？蒞使用與駿基反應(yīng)而形成胺反應(yīng)性中間體的1-己基-3-(3-二甲基氨基丙基）碳 二亞胺巧DC)使具有表面駿基（C00H)基團(tuán)的標(biāo)記一步綴合至含有N&的陽G。b)標(biāo)準(zhǔn)綴 合技術(shù)也可W應(yīng)用于制備綴合至抗聚合物配體（諸如抗PEG抗體）的標(biāo)記。該尤其包括抗 體與標(biāo)記表面的非共價(jià)吸收，或其使用邸C的共價(jià)連接（示出）。C)相似的綴合策略可應(yīng) 用于使配體（諸如DNA、膚、蛋白質(zhì)或抗體）與聚合物官能化。示出的是含有NHS的PEG與 蛋白質(zhì)或抗體的含有胺的賴氨酸殘基的綴合。除了 PEG聚合物，該些綴合策略可W擴(kuò)展至 本發(fā)明的其它聚合物。
[0043] 圖4示出在PEG作為第一聚合物、抗PEG抗體作為配體并且Pluronic F68作為第 二聚合物的BIAcore 3000表面等離子共振儀上進(jìn)行的可逆標(biāo)記測定的結(jié)果。a)使用邸C 綴合化學(xué)將駿化的CM5傳感器芯片用胺化的lOkDA PEG官能化。使用所示濃度故直定流速 將抗PEG抗體（克隆C肥074)注射到表面上保持120砂（締合）。接著，將hepes緩沖鹽水 (皿巧緩沖液注射到表面上保持180砂（解離）。觀察到抗PEG對PEG化表面的特異性和 濃度依賴性結(jié)合，而未觀察到抗CD8抗體對照的結(jié)合。b)示出在注射陽G衍生物Pluronic F68的1% (w/v)溶液后快速釋放抗PEG抗體。使用甘氨酸-HCL緩沖液使表面再生。此數(shù) 據(jù)的顯著特征是在加入Pluronic F68后快速（<1砂）并高效（>95% )去除表面結(jié)合的抗 PEG。使用雙分子結(jié)合模型并考慮質(zhì)量傳遞限制因素估計(jì)來自締合和解離步驟的抗PEG抗 體的親和力化D)在1. 8-7. 8nM的范圍內(nèi)。
[0044] 圖5示出在使用綴合至陽G的顆粒狀聚苯己帰標(biāo)記作為第一聚合物、抗陽G抗體 作為配體和Pluronic F68作為第二聚合物的流式細(xì)胞儀上進(jìn)行的可逆標(biāo)記測定法的結(jié)果。 a)使20kDa陽G綴合至6.0um聚苯己帰（P巧顆粒并且在初始標(biāo)記和下游逆轉(zhuǎn)（釋放）中 評估其與抗PEG抗體（克隆3F12-1)相互作用的特異性。b)當(dāng)PEG化的PS顆粒與抗PEG 一起溫育時(shí)，檢測到超過背景（灰色填充）的信號(hào)（實(shí)線）。加入1 % (w/v)的Pluronic F68后，信號(hào)被減少到接近背景（虛線），該表明PEG/抗陽G相互作用的有效可逆性。當(dāng) Pluronic F68在PS顆粒之前加至抗PEG抗體中時(shí)，沒有檢測到相互作用（虛線），該證實(shí) 具有抑制作用。C)作為對照，PS顆粒與抗PEG(實(shí)線）一起溫育，但第二聚合物是5kDA葡 聚糖。沒有信號(hào)減少（虛線），該表明Pluronic F68對釋放的特異性。當(dāng)抗葡聚糖（克隆 DX1)取代抗PEG (虛線）與PS顆粒一起溫育時(shí)未檢測到信號(hào)，該表明PEG/抗陽G相互作用 的特異性。在所有樣品中，使用大鼠抗小鼠PE作為報(bào)道分子來檢測抗體。
[0045] 圖6示出在使用綴合至PEG的顆粒狀磁性標(biāo)記作為第一聚合物、英光抗PEG抗體 作為配體和各種PEG衍生物作為第二聚合物的流式細(xì)胞儀上進(jìn)行的可逆標(biāo)記測定法的結(jié) 果。a)使30kDa陽G綴合的磁性微粒與英光抗PEG抗體一起溫育，同時(shí)用不同濃度和大小的 PEG來探測相互作用。為了測試第二聚合物對配體的抑制效果，在與PEG化的顆?；旌希ㄒ?巧||)之