基于親和色譜測定超分子相互作用解離速率常數(shù)的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于親和色譜的解離速率常數(shù)的測定方法，特別是針對相互作用 較弱、較廣泛的超分子相互作用。
【背景技術】
[0002] 超分子一般是兩個或兩個以上分子的集合體，藥物與輔料形成的超分子通常是主 分子(超分子載體）與客分子(藥物）通過氫鍵、范德華力等非共價相互作用形成的分子復合 物。藥物與超分子載體，如環(huán)糊精、冠醚和樹枝狀聚合物等，形成超分子復合物后能改善藥 物的水溶性、生物利用度和靶向性，在抗腫瘤、抗炎等領域發(fā)揮著重要作用。
[0003] 主客分子之間的相互作用，即主客體識別，是超分子發(fā)揮其特殊功能的基礎，不僅 是超分子化學的研究內(nèi)容之一，也是分子間相互作用的集中體現(xiàn)。主客體識別過程并非通 過傳統(tǒng)的共價鍵相結合，而是依靠分子間非共價鍵相互作用如：范德華力、靜電力、疏水相 互作用和氫鍵等實現(xiàn)結合。研究主客分子相互作用，有助于了解和揭示超分子結構與功能 的內(nèi)在關系，對闡明主客分子間的作用過程以及從分子水平上闡述超分子增溶、改善生物 利用度的作用機理等方面具有非常重要的理論價值；同時對于以超分子體系給藥的化合物 篩選具有重要的實用價值。此外，也能為指導設計高效、低毒的主分子提供有價值的信息。 但現(xiàn)有超分子相互作用研究大多停留在主分子衍生物合成、超分子表征、制劑制備和體外 細胞活性等，有關超分子主客體相互作用的動力學研究較少。
[0004] 主分子H (Host)與客分子G (Guest)所形成的非共價復合物H-G的生成與解離， 分別可用雙分子速率常數(shù)km及單分子速率常數(shù)I^ ff來表征。前者也稱為結合速率常數(shù)ka， 后者也稱為解離速率常數(shù)kd。
【主權項】
1. 一種基于親和色譜測定超分子相互作用解離速率常數(shù)的方法，該方法包括以下步 驟： (1) 提供一種鍵合有目標主分子的親和色譜柱； (2) 用流動相制備一定濃度的第一待分析客分子的樣品溶液； (3) 以帶流出方式將所述第一待分析客分子的樣品溶液以一定流速注入色譜系統(tǒng)，采 集第一待分析客分子在親和色譜柱上的流出曲線，并通過峰擬合計算第一待分析客分子流 出曲線的保留時間、半峰寬及塔板高度（H k); (4) 用與第一待分析客分子相同的流動相制備第二待分析客分子的樣品溶液； (5) 采用與第一待分析客分子相同的方式獲得第二待分析客分子流出曲線的保留時 間、半峰寬及塔板高度（Hm，。）； (6) 按照（1)~（5)中所述的方法重復測定其他至少三個不同流速下的Hk和Hm,c ; (7) 比較各個Hk與Hstc的大小，若三分之二數(shù)目以上的HK>H M，C，則以Hstc作為Hm采用公 式（3)通過H k-Hm對uV( 1+k)2做線性回歸，由斜率計算kd，app :
其中，u為線速度，k為容量因子； 若三分之二數(shù)目以上的HK〈HM，C，則按照一定的校正方法對H stc進行校正，得到HM，T，并采 用校正后的HM，T作為Hm按照公式（3)計算kd， app ; (8) 按照（1)~（7)中所述的方法測定第一待分析客分子在空白色譜柱上的容量因子 ^control 和解離速率常數(shù)kd，_tMl; (9) 通過第一待分析客分子在親和色譜柱與空白色譜柱上的容量因子比值判斷第一待 分析客分子與空白基質(zhì)相互作用的強弱，并采用公式（4)計算k d。（ a _tMl為k_tMl與k的 比值，O1=I-Cicontrol)
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述主分子是超分子體系的主體分子，包括環(huán)糊 精、冠醚、杯芳烴、葫蘆脲、樹枝狀聚合物、膠束、脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)或多肽。
3. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述親和色譜柱是市售或自制的色譜柱，包括填 充柱、整體柱中的一種或多種，長度在Imm~25cm。
4. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述親和色譜柱的固定相是將目標主分子鍵合 到色譜基質(zhì)上，所述色譜基質(zhì)包括聚丙烯酰胺及其衍生物、甲基丙烯酸酯共聚物、脲醛樹脂 或高交聯(lián)度苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，以及纖維素、硅膠載體中的一種或多種； 所述流動相包括甲醇、乙腈、水、醋酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、Tris-鹽酸緩沖液中的 一種或多種，且其pH值為2~8。
5. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述第一待分析客分子是指能與主分子發(fā)生非 共價相互作用的有機小分子，其為生物特效配位體、染料、電荷轉移配位體、包合配合物配 位體中的一種或多種； 所述第二待分析客分子是不與主分子發(fā)生非共價相互作用的物質(zhì)，其為水、甲醇、乙 醇、硝酸鈉、溴化鉀、檸檬酸、尿嘧啶中的一種或多種。
6. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述一定濃度是指能夠保證色譜行為重現(xiàn)性的、 信噪比大于10的符合線性洗脫的濃度； 所述一定流速是能夠使相互作用成為影響第一待分析客分子色譜峰展寬的主要因素 的流速。
7. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述的校正方法為： 理想第二待分析客分子的范第姆特方程為
常規(guī)第二待分析客分子的范第姆特方程為：
根據(jù)第二待分析客分子在親和色譜柱上的流出曲線，通過擬合常規(guī)第二待分析客分子 的范第姆特方程，得到A。和B。，其中，Hst。為計算得到的塔板高度，u為線速度； 對于同一根親和色譜柱，At與A。相同； 根據(jù)公式B1. = · B(.計算得到Bt，其中，Vt和&分別表示理想第二待分析客分子和 ντ 常規(guī)第二待分析客分子在常壓沸點條件下的摩爾體積； 根據(jù)公式
汁算得到Csi^t，其中，d p在色譜柱的說明書中有記載，k為 容量因子，Dt為理想第二待分析客分子在流動相中的分子擴散系數(shù)； 根據(jù)以上方法，即可通過對Hst。進行校正計算得到Hm，t。
8. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，當?shù)谝淮治隹头肿釉谟H和色譜柱與空白色譜 柱上的容量因子的比值< 〇. 1時，采用公式（3)計算的kd，app的值近似作為kd。
9. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述色譜系統(tǒng)是常規(guī)的高效液相色譜系統(tǒng)，由 泵、進樣器、柱溫箱、檢測器和色譜工作站組成，所述檢測器包括光學檢測器、熱學檢測器、 電化學檢測器、電學檢測器、放射性檢測器以及氫火焰離子化檢測器、質(zhì)譜檢測器中的一種 或多種。
10. -種基于親和色譜測定超分子相互作用解離速率常數(shù)的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括以下部 件： (1) 一種鍵合有目標主分子的親和色譜柱； (2) -種未鍵合目標主分子的空白色譜柱； (3) -種色譜系統(tǒng)，其具有部件（1)或（2)中所述的色譜柱，用于以帶流出方式將第一 待分析客分子的樣品溶液以一定流速注入時，采集所述第一待分析客分子在所述未鍵合目 標主分子的空白色譜柱上的流出曲線；以帶流出方式將第一待分析客分子的樣品溶液以一 定流速注入時，采集所述第一待分析客分子在所述鍵合有目標主分子的親和色譜柱上的流 出曲線；以及以同樣的方式采集第二待分析客分子在所述鍵合有目標主分子的親和色譜柱 上的流出曲線； (4) 第一計算部件，其用于在具有部件（1)或（2)中所述的色譜柱的情況下，分別通過 峰擬合計算第一待分析客分子流出曲線的保留時間、半峰寬及塔板高度（?);以及用于通 過峰擬合計算第二待分析客分子流出曲線的保留時間、半峰寬及塔板高度（H stc); (5) 第二計算部件，其用于比較在具有部件（1)或（2)中所述的色譜柱的情況下，所述 第一計算部件中計算得到的對應于相同色譜柱的至少三個不同流速下的H k和Hstc;而且， 若三分之二數(shù)目以上的HK>HM，C，則以Hstc作為H m采用公式（3)通過Hk-Hm對uV(l+k)2 做線性回歸，由斜率計算kd，app作為所述鍵合有目標主分子的親和色譜柱的解離速率常數(shù)以 及作為所述未鍵合目標主分子的空白色譜柱的解離速率常數(shù)；
其中，u為線速度，k為容量因子； 若三分之二數(shù)目以上的HK〈HM，C，則按照一定的校正方法對H stc進行校正，得到HM，T，并采 用校正后的HM，T作為Hm按照公式（3)計算kd， app以及kd，_tMl ; (6) 第三計算部件，其通過第一待分析客分子在親和色譜柱與空白色譜柱上的容量因 子比值判斷第一待分析客分子與空白基質(zhì)相互作用的強弱，并采用公式（4)計算k d，其中 a control 為 Κοινο? 與 k 的比值，Ct「1_ Ct control?
【專利摘要】本發(fā)明涉及基于親和色譜測定解離速率常數(shù)的方法，特別是針對相互作用較弱、較廣泛的超分子相互作用。所述方法是將主分子先進行固定再測定的基于定量親和色譜的方法。所述方法包括：在一定溫度條件下，在多個流速下分別采集第一待分析客分子與第二待分析客分子在鍵合有目標主分子的親和色譜柱上的色譜流出曲線，通過峰擬合計算保留時間、半峰寬及塔板高度，計算解離速率常數(shù)。本發(fā)明無需特殊儀器設備，利用常規(guī)色譜分析方法，可測得超分子弱相互作用的動力學速率常數(shù)，同時可與紫外、熒光及質(zhì)譜等多種檢測器聯(lián)用，在低濃度、水溶性差的藥物檢測方面，以及超分子相互作用動力學參數(shù)的低成本、快速測定方面具有獨特優(yōu)勢。
【IPC分類】G01N30-88
【公開號】CN104634909
【申請?zhí)枴緾N201310567416
【發(fā)明人】李海燕, 葛靜文, 殷憲振, 孫立新, 張繼穩(wěn)
【申請人】中國科學院上海藥物研究所
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2013年11月14日