acroglobulin) ;3， 免疫球蛋白G(IgG) ;4,纖維素蛋白原（Fibrinogen) ;5,血清補(bǔ)體蛋白C3(Complement C3) ;6，轉(zhuǎn)鐵蛋白質(zhì)（Serotransferrin) ;7，免疫球蛋白M(IgM) ;8，α-1-抗胰蛋白酶 (Alpha-1-antitrypsin) ;9，免疫球蛋白 A(IgA) ; 10，觸珠蛋白（HPR Haptoglobin)。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面采用具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明。
[0023] 實(shí)施例1
[0024] 1.寡核苷酸文庫修飾的磁性顆粒的制備取15mgl. 0 μ m四氧化三鐵磁性顆粒，將 1.0 mL摩爾濃度為10 μ M的寡核苷酸文庫溶液與該磁性顆粒在IOmM Tris-HCl緩沖溶液 中室溫條件孵育反應(yīng)2h，寡核苷酸文庫中寡核苷酸鏈的堿基長(zhǎng)度為60,反應(yīng)后的溶液采用 IOmM Tris-HCl溶液洗滌3次。
[0025] 2.樣品處理過程
[0026] 將蛋白質(zhì)樣品（血漿或組織樣品）采用20mM Tris-HCl緩沖溶液稀釋（pH=7. 4)至 10mg/mL，將上述樣品（ImL)加入上述制備的寡核苷酸文庫修飾的磁性顆粒中，4度條件下 孵育2h。磁鐵分離顆粒與上清液后，取出上清液。顆粒采用Tris-HCl緩沖溶液洗滌3后， 再分別采用2M NaCl，100mM Gly-HCl，4M尿素溶液(含有IOmM EDTA)和4%十二烷基磺酸鈉 溶液(含有25mM DTT)進(jìn)行洗滌，每種試劑分別洗滌3次后，磁鐵分離顆粒并收集各洗脫液。
[0027] 3.蛋白質(zhì)酶解過程
[0028] 將上述洗脫液與原始血清蛋白質(zhì)樣品分別進(jìn)行胰酶酶解。具體過程如下：將樣品 在90°C條件下變性20min，加入適量的二硫蘇糖醇(每毫克蛋白質(zhì)加入8 μ mol二硫蘇糖醇 溶液）于56°C反應(yīng)I. 5h，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的還原過程，再按比例加入碘乙酰胺溶液（1 μ mol二 硫蘇糖醇加入2. 5 μ mol IAA)，在避光條件下反應(yīng)30min對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行烷基化，最后加入膜 蛋白酶(胰蛋白酶與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比例為1:25)，37°C反應(yīng)16h。
[0029] 4.反相液質(zhì)聯(lián)用分析與數(shù)據(jù)處理
[0030] 將上述蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行反相液質(zhì)（RPLC-MS/MS)分析。采用兩種流動(dòng)相：流動(dòng) 相A為2%乙腈，98% 7K，〇. 1%甲酸；流動(dòng)相B為98%乙腈，2% 7K，〇. 1%甲酸。當(dāng)樣品載于RP 捕集柱上之后，再采用如下分離梯度進(jìn)行反相分離，〇-5%B,分離5min ;5-35%B，分離95min ; 35-80%B，分離5min，之后采用80%流動(dòng)相B沖洗lOmin。LTQ質(zhì)譜采用正離子掃描模式，碰撞 能量為35%。采用Mascot (2. 4. Oversion)檢索質(zhì)譜得到的數(shù)據(jù)，搜索數(shù)據(jù)庫為IPI_human_ ν3·8·7(91464 sequence)。采用顯著性因子P〈0.05，ion score>20對(duì)檢索結(jié)果進(jìn)行處理得 到1?度可?目的蛋白質(zhì)。
[0031] 對(duì)得到的蛋白質(zhì)列表信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表1所示。
[0032] 表1洗脫體系4個(gè)組分及原始血漿樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定結(jié)果；
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 寡核苷酸文庫修飾的基質(zhì)材料，其特征在于：基質(zhì)材料為磁性顆粒、聚丙烯酸酯類 聚合物基質(zhì)顆?；蚪痤w粒，寡核苷酸文庫是人工合成的隨機(jī)寡核苷酸文庫，寡核苷酸鏈的 序列具有隨機(jī)性；寡核苷酸鏈鍵合于基質(zhì)材料表面。
2. 按照權(quán)利要求1所述的材料，其特征在于：基質(zhì)材料粒徑為I. 0nm-50mm，寡核苷酸文 庫中寡核苷酸鏈的堿基數(shù)目在20-100之間。
3. 按照權(quán)利要求1所述的寡核苷酸文庫修飾的材料，其特征在于：寡核苷酸文庫與基 質(zhì)材料的鍵合方式為：生物素-親和素相互作用，羧酸根與氨基反應(yīng)鍵合，金與巰基鍵合， 雙鍵與雙鍵反應(yīng)中的一種或二種以上。
4. 按照權(quán)利要求1所述的材料，其特征在于： 所述磁性顆粒為四氧化三鐵磁性顆粒，聚丙烯酸酯類聚合物為聚丙烯酸甲酯、聚丙烯 酸乙酯、聚丙烯酸丁酯等以丙烯酸酯為單體的聚合物。
5. -種權(quán)利要求1或2所述的寡核苷酸文庫修飾的基質(zhì)材料的制備方法，其制備過程 包括以下具體步驟： (1)磁性基質(zhì)顆粒：將寡核苷酸文庫溶液與磁性顆粒以0. 2-10nmol/mg比例在三羥甲 基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液（Tris-HCl)中室溫條件下反應(yīng)0.5-12h，得寡核苷酸文庫修飾 的磁性顆粒材料； 或（2)聚丙烯酸酯基質(zhì)材料：將寡核苷酸文庫溶液與功能化的聚丙烯酸酯基質(zhì)材料以 0. 5-250nmol/mg的比例在磷酸緩沖溶液中室溫條件下反應(yīng)3-24h，得寡核苷酸文庫修飾的 聚丙烯酸酯基質(zhì)材料； 或（3)金顆粒：將寡核苷酸文庫溶液與金顆粒以摩爾數(shù)為50:1的比例在水溶液中室溫 條件下反應(yīng)l_6h，得寡核苷酸文庫修飾的金顆粒材料。
6. -種權(quán)利要求1-4任一所述的寡核苷酸文庫修飾的基質(zhì)材料的應(yīng)用，其用于蛋白質(zhì) 樣品預(yù)處理的過程：修飾寡核苷酸文庫的材料采用IO-IOOmM Tris-HCl緩沖液洗滌2-5次 后，與蛋白質(zhì)樣品在1_25°C條件下孵育0. 5-10h ;去除上清；采用20-150mM Tris-HCl緩沖 液洗滌材料4-6次，去除上清后，依次采用氯化鈉溶液洗滌3-6次、甘氨酸溶液洗滌3-6次、 尿素溶液洗滌3-6次和十二烷基磺酸鈉溶液洗滌3-6次，并分別收集不同洗脫液洗滌后的 溶液，即獲得蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理后的4個(gè)組份。
7. 按照權(quán)利要求5所述的制備的材料的應(yīng)用，蛋白質(zhì)樣品包括體液或組織樣品中的一 種或二種以上。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種寡核苷酸文庫作為配基的材料，及其在蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理方面的應(yīng)用。該材料用于蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理能夠有效降低樣品中高豐度蛋白質(zhì)的豐度，減小高豐度蛋白質(zhì)與低豐度蛋白質(zhì)之間的豐度差異。相比于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理方法，具有方便易行、成本低廉等特點(diǎn)。
【IPC分類】G01N30-89
【公開號(hào)】CN104634915
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310557895
【發(fā)明人】張麗華, 鄧楠, 梁振, 朱貴杰, 楊開廣, 張玉奎
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
【公開日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2013年11月8日