一種免疫磁性微球的制備方法、以及含有免疫磁性微球的蘇丹紅檢測試劑盒和檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分析檢測領(lǐng)域，具體涉及一種免疫磁性微球的制備方法、以及含有免 疫磁性微球的蘇丹紅檢測試劑盒和檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蘇丹紅是一種化學(xué)染色劑，被廣泛用于溶劑、油、蠟、汽油的增色以及鞋、地板等的 增光方面。它并非食品添加劑，但由于其染色鮮艷，常被非法添加到辣椒粉等調(diào)味品中。它 的化學(xué)成份中具有偶氮結(jié)構(gòu)，由于這種化學(xué)結(jié)構(gòu)的性質(zhì)決定了它具有致癌性，對人體的肝 腎器官具有明顯的毒性作用，因此被嚴(yán)禁添加到食品中。
[0003] 目前蘇丹紅的檢測方法有高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用等，雖然這些方法靈敏度高， 但前處理操作復(fù)雜，儀器價(jià)格昂貴，且需要專業(yè)的技術(shù)人員進(jìn)行檢測，不適合快速篩查大批 量樣品。目前可用于現(xiàn)場快速檢測的方法如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)，相比之下應(yīng)用起來 較為靈活，但檢測復(fù)雜樣品時(shí)，待測樣品中的基質(zhì)影響較大，不利于低含量蘇丹紅樣品的檢 測。因此，急需開發(fā)一種能夠避免處理復(fù)雜樣品時(shí)受基質(zhì)影響較大的檢測方法，從而可以避 免檢測樣品時(shí)基質(zhì)的影響，準(zhǔn)確檢測到待測樣品中蘇丹紅的濃度。
[0004] 磁性微球表面帶不同的化學(xué)官能團(tuán)，如羧基C00H、氨基NH2、二氧化硅Si0 2、C18、環(huán) 氧基、鏈霉親和素 、Protein A等。磁性微球具有單分散性好、磁響應(yīng)強(qiáng)、穩(wěn)定性好、親水性 強(qiáng)、表面官能團(tuán)含量高等特點(diǎn)。近年來，免疫磁性微球越來越廣泛地應(yīng)用于生物分離純化、 免疫分析、生物檢測等領(lǐng)域，顯不出靈敏度1?、方便、快捷、1?效、復(fù)雜樣品基質(zhì)影響小等特 點(diǎn)。免疫磁性微球的制備一般為通過化學(xué)共價(jià)偶聯(lián)，如EDC (碳二亞胺)法等，通過活化磁性 微球，使磁性微球上活化的基團(tuán)與抗體或抗原共價(jià)結(jié)合，將抗體或抗原偶聯(lián)到磁性微球上， 從而形成免疫磁性微球(或免疫磁珠)。但是，某些免疫磁性微球的制備過程中，偶聯(lián)效率 較低，貯存穩(wěn)定性較差，嚴(yán)重影響了免疫磁性微球的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為克服免疫磁性微球制備過程中偶聯(lián)率低、穩(wěn)定性差的缺陷，本發(fā)明的目的是提 供一種免疫磁性微球的制備方法。
[0006] 本發(fā)明提供的免疫磁性微球制備方法，包括磁性微球活化的步驟以及磁性微球與 抗體或抗原偶聯(lián)的步驟，其中，所述活化和/或偶聯(lián)的步驟中采用以下緩沖液：包含體積百 分比為0. 01%~0. 1%的吐溫-20以及質(zhì)量百分比為0. 01%~0. 1%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP) 的磷酸鹽緩沖液（PB緩沖液)。
[0007] 優(yōu)選地，所述緩沖液為包含體積百分比為0. 01%~0. 05%的吐溫-20以及質(zhì)量百 分比為0. 01%~0. 05%的聚乙烯吡咯烷酮的PB緩沖液。
[0008] 優(yōu)選地，所述PB緩沖液的濃度為10~20mM (毫摩爾/升)，pH值為5. 8~6. 2。
[0009] 其中，所述磁性微球?yàn)楸砻鎺в恤然拇判晕⑶颍凰隹贵w為蘇丹紅單克隆抗體； 優(yōu)選地，所述磁性微球的粒徑為1~3 μ m，羧基含量為200~300 μ moL/g。
[0010] 為克服現(xiàn)有蘇丹紅檢測過程中易受樣品基質(zhì)影響的缺陷，提供一種快速、準(zhǔn)確的 蘇丹紅檢測方案，本發(fā)明的另一目的是提供一種含有免疫磁性微球的蘇丹紅檢測試劑盒。 [0011] 此外，本發(fā)明的還一目的是提供蘇丹紅的檢測方法。
[0012] 本發(fā)明提供的含有免疫磁性微球的蘇丹紅檢測試劑盒，包括以下組分：
[0013] (1)按照以上技術(shù)方案任一項(xiàng)所述免疫磁性微球制備方法制得的蘇丹紅單克隆抗 體結(jié)合的免疫磁性微球；（2)蘇丹紅酶結(jié)合物；（3)樣品稀釋液；（4)蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液； (5)底物顯色液；（6)終止液；（7)洗滌液。
[0014] 其中，所述蘇丹紅酶結(jié)合物為辣根過氧化酶（HRP)標(biāo)記的蘇丹紅抗原。
[0015] 其中，所述樣品稀釋液為包含5%~10%體積的甲醇、0. 05%~0. 1%體積的乳化劑 丁父-100(1'1^〇11乂-100)的0.01~0.021磷酸鹽緩沖生理鹽水（？85)，其？!1值為7.2~ 7. 4。
[0016] 其中，所述蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液為蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶于所述樣品稀釋液所得溶液，濃 度分別為：〇ng/mL、0. 2ng/mL、0. 6ng/mL、I. 8ng/mL 和 5. 4ng/mL。
[0017] 其中，所述底物顯色液由A液和B液組成，顯色液的A液為過氧化脲顯色液，B液 為四甲基聯(lián)苯胺（TMB)顯色液。
[0018] 其中，所述終止液為1. 8~2. OM的硫酸溶液。
[0019] 其中，所述洗滌液為包含0. 1%~0. 5%體積的吐溫-20的10~20mM磷酸鹽緩沖 生理鹽水（PBS)，其pH值為7. 0~7. 4。
[0020] 本發(fā)明提供的蘇丹紅檢測方法為：采用以上技術(shù)方案任一項(xiàng)所述的試劑盒檢測待 測樣品中的蘇丹紅。
[0021] 本發(fā)明提供的免疫磁性微球制備方法使用了含有吐溫-20以及聚乙烯吡咯烷酮 的PB緩沖液，相對于目前常用的緩沖液，能夠起到良好的增溶、分散和保護(hù)作用，有利于磁 性微球與抗體或抗原進(jìn)行偶聯(lián)，偶聯(lián)率明顯提高。所得免疫磁性微球穩(wěn)定性好，能在2~ 8 °C條件下保存一年以上，也不發(fā)生脫落現(xiàn)象。
[0022] 本發(fā)明提供的試劑盒采用了酶聯(lián)免疫檢測原理的直接競爭法，檢測時(shí)間短，能同 時(shí)檢測大批量樣品。本發(fā)明提供的試劑盒使用了蘇丹紅單克隆抗體包被的免疫磁性微球， 靈敏度高、方便快捷，可用于大批量樣品的快速篩查。
[0023] 本發(fā)明提供的檢測方法與常規(guī)的微孔板ELISA法相比，由于采用磁性微球進(jìn)行了 磁分離，故可避開待測樣品時(shí)基質(zhì)的影響，準(zhǔn)確檢測到樣品中蘇丹紅的濃度。此外，本發(fā)明 的檢測方法還有對待測樣品需求量少、對儀器設(shè)備要求低、試劑保存時(shí)間長等優(yōu)點(diǎn)，可以在 食品安全檢測中發(fā)揮重要作用，有重大的社會(huì)意義和廣闊的市場前景。
【附圖說明】
[0024] 圖1為實(shí)施例3中采用本發(fā)明試劑盒檢測得到的蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0025] 圖2為實(shí)施例3中采用微孔板ELISA檢測得到的蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0026] 圖3為實(shí)施例7中本發(fā)明試劑盒的穩(wěn)定性檢測結(jié)果，時(shí)間間隔為7天，在37°C條件 下保存。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 本發(fā)明實(shí)施方式中涉及到的百分號" ％"，若未特別說明，是指質(zhì)量百分比；但溶液 的百分比，除另有規(guī)定外，是指溶液IOOmL中含有溶質(zhì)若干克；液體之間的百分比，是指在 20°C時(shí)的體積比例。如無特別說明，本發(fā)明實(shí)施方式中涉及到的操作均為本領(lǐng)域的常規(guī)操 作，涉及的試劑均為常見市售試劑。
[0028] 本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種免疫磁性微球的制備方法，包括磁性微球活化的步 驟以及磁性微球與抗體或抗原偶聯(lián)的步驟，其中，所述活化和/或偶聯(lián)的步驟中采用以下 緩沖液：包含體積百分比為〇. 01%~〇. 1%的吐溫-20以及質(zhì)量百分比為0. 01%~0. 1%的 聚乙烯吡咯烷酮（PVP)的磷酸鹽緩沖液（PB緩沖液)。
[0029] 免疫磁性微球的制備過程通常為：將表面帶有化學(xué)官能團(tuán)的磁性微球在活化緩沖 液中通過活化劑進(jìn)行活化，再將活化后的磁性微球置于偶聯(lián)緩沖液中，在其中與抗體或抗 原進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，偶聯(lián)反應(yīng)完畢后封閉磁性微球表面未反應(yīng)的位點(diǎn)，然后將得到的免疫磁 性微球進(jìn)行使用或?qū)⑵浞稚⒂谫A存液中進(jìn)行保存。磁性微球的活化多使用MES (2-嗎啉乙 磺酸)作為緩沖液，但本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在某些磁性微球與抗體或抗原的偶聯(lián)反應(yīng)中，使用MES 緩沖液所得的偶聯(lián)率較差，且所得免疫磁性微球穩(wěn)定性較差，容易產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。經(jīng)過大量 實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明人采用了上述PB緩沖液作為活化和/或偶聯(lián)緩沖液，能夠起到良好的增溶、分 散和保護(hù)作用，從而有效提高了偶聯(lián)率，并提高了免疫磁性微球的穩(wěn)定性。
[0030] 優(yōu)選地，所述PB緩沖液包含體積百分比為0. 01%~0. 05%的吐溫-20以及質(zhì)量百 分比為0. 01%~0. 05%的聚乙烯吡咯烷酮。
[0031] 優(yōu)選地，PB緩沖液的濃度為10~20mM，pH值為5. 8~6. 2。
[0032] 在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，免疫磁性微球的制備方法包括以下步驟：
[0033] ( 1)將磁性微球用活化緩沖液洗滌2~3次后，分散在活化緩沖液中。
[0034] (2)加入活化劑混合反應(yīng)，其中所述活化劑為EDC和NHS (N-羥基琥珀酰亞胺）的 混合物。
[0035] (3)將活化后的磁性微球用偶聯(lián)緩沖液洗滌2~3次后，分散在偶聯(lián)緩沖液中。
[0036] (4)加入抗體或抗原，進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。
[0037] (5)加入封閉液，封閉免疫磁性微球表面未反應(yīng)的位點(diǎn)。
[0038] (6)使用所得的免疫磁性微球，或?qū)⑵溆觅A存液洗滌2~3次后，分散在貯存液中。
[0039] 其中，EDC和NHS的加入量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)具體需要確定