微生物細(xì)胞表面抗原的篩選與鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種簡便、快捷篩選和鑒定微生物細(xì)胞表面蛋白抗原的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 業(yè)已證明，采用疫苗接種是預(yù)防微生物疾病有效、經(jīng)濟(jì)的免疫干預(yù)途徑。微生物 細(xì)胞表面蛋白由于定位于細(xì)胞表面，與宿主免疫系統(tǒng)直接接觸，其刺激機(jī)體產(chǎn)生的特異性 抗體與相應(yīng)的微生物細(xì)胞表面蛋白結(jié)合后，通過中和作用抑制微生物感染，或介導(dǎo)免疫細(xì) 胞的吞噬，在病原體入侵最初階段即可發(fā)揮作用。因此微生物細(xì)胞表面蛋白是良好的疫苗 候選蛋白，也是研究的熱點(diǎn)。如學(xué)者發(fā)現(xiàn)弧菌細(xì)胞表面蛋白OmpA、OmpU等具有良好的免疫 原性和免疫保護(hù)性，可作為疫苗的候選蛋白。在微生物細(xì)胞表面蛋白抗原篩選方面，常規(guī)免 疫蛋白組學(xué)采用的是先分離微生物細(xì)胞表面蛋白、然后進(jìn)行免疫印記篩選，但提取細(xì)胞表 面蛋白，特別是外膜蛋白存在一定的困難，而且分離外膜蛋白的二維電泳操作繁瑣，重復(fù)性 差，對(duì)低拷貝蛋白、極端等電點(diǎn)蛋白不能展示。而且現(xiàn)提取分析微生物細(xì)胞表面蛋白，破壞 了細(xì)胞表面蛋白的天然結(jié)果，不能很好反應(yīng)出體內(nèi)免疫反應(yīng)的過程。這在一定程度上限制 了它的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明旨在提供一種簡單、快捷的篩選和鑒定微生物細(xì)胞表面抗原的方法，其技 術(shù)是利用免疫沉淀使微生物全細(xì)胞與微生物抗血清中的微生物細(xì)胞表面蛋白抗體發(fā)生免 疫反應(yīng)，超聲處理抗體與微生物全細(xì)胞復(fù)合物，再用蛋白A/G瓊脂糖捕捉抗原抗體復(fù)合物。 SDS-PAGE簡單分離抗原抗體復(fù)合物，確定具有免疫原性的蛋白質(zhì)，最后采用質(zhì)譜技術(shù)分析 和鑒定這些免疫原。
[0004] 本發(fā)明所說的微生物細(xì)胞表面抗原的篩選和鑒定方法的具體步驟如下：
[0005] 1)用微生物全細(xì)胞免疫沉淀分離出細(xì)胞表面蛋白抗體：微生物細(xì)胞收集后與微生 物抗血清按體積比抗血清：微生物=1 :500加入抗血清冰浴孵育，陰性血清作為對(duì)照，離心 去除抗血清細(xì)胞表面抗體外其他成份,收集微生物細(xì)胞與細(xì)胞表面抗體復(fù)合物；
[0006] 2)將分離出的微生物細(xì)胞與細(xì)胞表面抗體復(fù)合物，超聲波破碎后，用蛋白A/G瓊 脂糖與冰浴孵育，捕捉抗原抗體復(fù)合物，洗滌三次后，洗脫抗原抗體復(fù)合物；
[0007] 3)洗脫后的抗原抗體復(fù)合物SDS-PAGE分析，用銀染觀察結(jié)果，陰性對(duì)照沒有或很 少，實(shí)驗(yàn)組有或很多的蛋白條帶，該條帶中的所有蛋白即具有免疫原性，再使用超濾管對(duì)抗 原抗體復(fù)合物進(jìn)行濃縮后在進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色出現(xiàn)的陽性條帶準(zhǔn)備進(jìn) 行質(zhì)譜；
[0008] 4)免疫原的定性：取出具有免疫原性的全部考染蛋白質(zhì)條帶，按常規(guī)質(zhì)譜樣品處 理方法進(jìn)行樣品制備，然后進(jìn)行質(zhì)譜和生物信息分析，以確定抗原的蛋白質(zhì)種類。
[0009] 所說的微生物為細(xì)菌，真菌。
[0010] 超聲破碎時(shí)所采用的輸出功率、時(shí)間、次數(shù)和時(shí)間間隔可按研究對(duì)象進(jìn)行調(diào)整，一 般可采用每次3秒，間隔4秒，超聲2min。 toon] 所說的微生物抗血清是用微生物全細(xì)胞免疫動(dòng)物得到的特異性抗血清。
[0012] 本發(fā)明所采取的策略與傳統(tǒng)的免疫蛋白組學(xué)不同，是先進(jìn)行微生物細(xì)胞表面蛋白 與抗血清進(jìn)行免疫反應(yīng)，再簡單分離具有免疫原性的微生物細(xì)胞表面蛋白，最后利用質(zhì)譜 技術(shù)和生物信息學(xué)分析確定這些微生物表面蛋白抗原的種類。從而建立了一種新的基于免 疫沉淀的微生物細(xì)胞表面蛋白抗原篩選技術(shù)，用于高通量篩選具有免疫原性的微生物細(xì)胞 表面蛋白質(zhì)以作為多價(jià)疫苗的候選靶位。根據(jù)免疫原的豐度和與抗體的親和力，可以確定 其作為免疫原的可能性及其作用的效果。本發(fā)明可迅速確定某種微生物細(xì)胞表面的具有免 疫原性的全部蛋白質(zhì)，從而達(dá)到高效、快速、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的優(yōu)選免疫原的目的。本發(fā)明能夠高 通量篩選具有免疫原性的疫苗候選位點(diǎn)，為確定作為多價(jià)疫苗靶位的基因奠定了基礎(chǔ)，提 高了制備多價(jià)疫苗靶點(diǎn)的效率。由于所有微生物作為抗原免疫動(dòng)物后，機(jī)體均會(huì)產(chǎn)生針對(duì) 其抗原的特異性抗體，這些抗體可以用來免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，篩選免疫原，而且本發(fā)明不用二維 電泳分離細(xì)胞表面蛋白，極大得簡化了實(shí)驗(yàn)步驟。故本實(shí)驗(yàn)的原理和方法具有普遍性，操作 步驟簡單快捷，可高效用于細(xì)菌、真菌等微生物細(xì)胞表面抗原的鑒定。
[0013] 本發(fā)明進(jìn)一步發(fā)展了免疫沉淀技術(shù)的應(yīng)用，即建立了一種基于免疫沉淀的微生物 細(xì)胞表面抗原篩選技術(shù)，從而可以確定與微生物抗血清反應(yīng)的微生物細(xì)胞表面蛋白質(zhì)。由 于這一設(shè)計(jì)是基于最簡單的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，故不僅可以快速確定某種微生物所具有的細(xì)胞表面 抗原，還可以得知其在細(xì)胞表面的豐度和與抗體的親和力。根據(jù)這些免疫原的細(xì)胞表面豐 度和與抗體的親和力，確定作為多價(jià)靶位疫苗的可能性和判斷其作用效果。
【附圖說明】
[0014] 圖1為微生物細(xì)胞表面蛋白抗原篩選的實(shí)驗(yàn)流程圖
[0015] 圖2為病原微生物副溶血弧菌VPL4-90表面蛋白抗原篩選的電泳結(jié)果。
[0016] 其中，A、副溶血弧菌VPL4-90表面蛋白抗原篩選的銀染SDS-PAGE圖譜，包括對(duì)照 組和實(shí)驗(yàn)組；B、副溶血弧菌VPL4-90表面蛋白抗原篩選的實(shí)驗(yàn)組考染SDS-PAGE圖譜。
[0017] 圖3為病原微生物擬態(tài)弧菌ATCC33653表面蛋白抗原篩選的電泳結(jié)果。
[0018] 其中，A、擬態(tài)弧菌ATCC33653表面蛋白抗原篩選的銀染SDS-PAGE圖譜，包括對(duì)照 組和實(shí)驗(yàn)組；B、擬態(tài)弧菌ATCC33653表面蛋白抗原篩選的實(shí)驗(yàn)組考染SDS-PAGE圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 以下實(shí)施將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的工藝步驟及其突出效果作進(jìn)一步說明。
[0020] 實(shí)施例1
[0021] 1、細(xì)菌培養(yǎng)、計(jì)數(shù)和收集：微生物采用副溶血弧菌VPL4-90,為本實(shí)驗(yàn)室保存菌 種。將VPL4-90接種于LB培養(yǎng)基，28°C搖床培養(yǎng)18h。培養(yǎng)結(jié)束后，取2mL菌液進(jìn)行平板菌 落計(jì)數(shù)。其余培養(yǎng)液于5000rpm離心10min，收集菌體，用生理鹽水洗滌菌體3次。用生理 鹽水調(diào)整其濃度為IO 9CFUAiL。
[0022] 2、抗病原菌抗血清的制備：向制備的VPL4-90菌體懸液加入體積分?jǐn)?shù)0. 025%甲 醒，30°C下作用4h，制成滅活病原，5000rpm轉(zhuǎn)速IOmin,再用生理鹽水洗漆三次，最后再用 生理鹽水調(diào)整其濃度為10 9CFU/mL，注射新西蘭大白兔，每只lmL，對(duì)照組注射生理鹽水；每 隔一周注射一次，第四次免疫的第7天處死大白兔取血，靜置；4000rpm離心10min，取出血 清，分裝，_20°C保存。
[0023] 3、微生物細(xì)胞表面蛋白抗體的免疫沉淀，5mL的109CFU/mLVPL4-90PBS懸液加入 1 μ LVPL4-90菌體抗血清，5mLVm PBS懸液加入1 μ LVm菌體抗血清振蕩混勻，冰浴，50rpm搖 床過夜，同時(shí)各自加陰性血清作為對(duì)照。離心收集菌體，PBS洗滌三次，各加入0. 5ml的免 疫沉淀裂解液重懸，超聲破碎（300W，4s，3s，2min)，加入裝有樹脂和用塞子塞住的免疫沉淀 柱中，冰浴，50rpm8h。免疫沉淀柱用免疫沉淀洗滌液洗滌三次，用條件緩沖液洗滌一次，再 用洗脫液孵育5min后洗脫。
[0024] 4、SDS-PAGE電泳和銀染觀察：將收集到的免疫沉底復(fù)合物以及陰性對(duì)照進(jìn)行 SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，用硝酸銀染色，掃描，輸出照片。參見圖1-A，結(jié)果顯示，除抗體 重鏈和輕鏈連個(gè)條帶外，比較清楚的蛋白條陽性蛋白條帶有8個(gè)。
[0025] 5、樣品濃縮和考染質(zhì)譜：收集10個(gè)實(shí)驗(yàn)組的免疫沉淀柱的樣品，用超濾管在 5000rpm30min濃縮10倍后，上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，掃描，輸出照片。參見圖 1-B，除抗體重鏈和輕鏈連個(gè)條帶外，比較清楚的條帶有8個(gè)。將與銀染一致的6個(gè)條帶切 出送到華大基因和上海博苑進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸附的串聯(lián)質(zhì)譜分析和鑒定，鑒定結(jié)果見 表1。6個(gè)蛋白條帶鑒定出6個(gè)蛋白，其中有4個(gè)為副溶血弧菌細(xì)胞表面的外膜蛋白抗原，2 個(gè)是副溶血弧菌胞內(nèi)蛋白，但在一些研究中表明，從蛋白質(zhì)組學(xué)中分析，一些胞內(nèi)蛋白亦在 微生物細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)，其機(jī)制原理有待于深入研究。
[0026] 表1副溶血弧菌細(xì)胞表面抗原的MALDI-T0F-T0F/MS鑒定
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 微生物細(xì)胞表面抗原的篩選與鑒定方法，其特征在于其步驟如下： 1) 用微生物全細(xì)胞免疫沉淀分離出細(xì)胞表面蛋白抗體：微生物細(xì)胞收集后與微生物抗 血清按體積比抗血清：微生物=1:500加入抗血清冰浴孵育，陰性血清作為對(duì)照，離心去除 抗血清細(xì)胞表面抗體外其他成份，收集微生物細(xì)胞與細(xì)胞表面抗體復(fù)合物； 2) 將分離出的微生物細(xì)胞與細(xì)胞表面抗體復(fù)合物，超聲波破碎后，用蛋白A/G瓊脂糖 與破碎液冰浴孵育，捕捉抗原抗體復(fù)合物，洗滌三次后，洗脫抗原抗體復(fù)合物； 3) 洗脫后的抗原抗體復(fù)合物SDS-PAGE分析，用銀染觀察結(jié)果，確定陽性條帶，再使用 超濾管對(duì)抗原抗體復(fù)合物進(jìn)行濃縮后在進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色準(zhǔn)備進(jìn)行質(zhì) 譜； 4) 免疫原的定性：取出具有免疫原性的全部考染蛋白質(zhì)條帶，按常規(guī)質(zhì)譜樣品處理方 法進(jìn)行樣品制備，然后進(jìn)行質(zhì)譜和生物信息分析，以確定抗原的蛋白質(zhì)種類。
2. 如權(quán)利要求1所述的微生物細(xì)胞表面抗原的篩選與鑒定方法，其特征在于所說的微 生物為細(xì)菌，真菌。
3. 如權(quán)利要求1所述的微生物細(xì)胞表面抗原的篩選與鑒定方法，其特征在于采用微生 物全細(xì)胞免疫沉淀將微生物細(xì)胞表面蛋白的抗體從抗血清中分離出來。
4. 如權(quán)利要求1所述的微生物細(xì)胞表面抗原的篩選與鑒定方法，其特征在于超聲破碎 每次3s，間隔4s，超聲2min。
5. 如權(quán)利要求1所述的微生物細(xì)胞表面抗原的篩選與鑒定方法，其特征在于用銀染觀 察確定免疫原性蛋白條帶，用考馬斯亮藍(lán)染色進(jìn)行質(zhì)譜分析。
【專利摘要】微生物細(xì)胞表面蛋白抗原的篩選與鑒定方法，涉及一種簡便、快捷篩選和鑒定微生物細(xì)胞表面蛋白抗原的方法。用微生物全細(xì)胞免疫沉淀分離出細(xì)胞表面蛋白的抗體，蛋白A/G瓊脂糖捕捉抗原抗體復(fù)合物，洗脫得到抗原抗體復(fù)合物，再用SDS-PAGE分析免疫沉淀的蛋白。分析免疫原的豐度、抗體對(duì)抗原的親和力、免疫原的定性、確定抗原的蛋白種類。建立基于免疫沉淀的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，用于高通量篩選具有免疫原性的蛋白質(zhì)作為多價(jià)疫苗的候選靶位。根據(jù)免疫原的豐度和抗體對(duì)抗原的親和力，能確定其作為疫苗蛋白的可能性。迅速確定某種微生物細(xì)胞表面具有免疫原性的蛋白，高效、快速、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用。方法具有普遍性，不僅可以用于細(xì)菌，還可以用于真菌等微生物免疫原的鑒定。
【IPC分類】G01N33-68
【公開號(hào)】CN104634979
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310574194
【發(fā)明人】胡忠, 袁傳飛, 倫鏡盛, 張?jiān)O(shè)熙
【申請(qǐng)人】汕頭大學(xué)
【公開日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2013年11月15日