醛固酮檢測(cè)試劑盒及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)試劑盒，具體涉及一種用于檢測(cè)醛固酮的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè) 試劑盒。本發(fā)明還涉及該試劑盒的制備方法，以及使用該試劑盒來檢測(cè)醛固酮濃度的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 醛固酮（ALD)是一種由腎上腺皮質(zhì)球狀帶細(xì)胞合成并分泌的鹽皮質(zhì)激素， 正常情況下，受腎素-血管緊張素系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng) (renin-angiotensin-aldosterone system, RAAS)是一個(gè)激素系統(tǒng)，當(dāng)大量失血或血壓下 降時(shí)，腎臟分泌腎素，腎素催化血管緊張素原水解產(chǎn)生血管緊張素 I (A I )，A I基本沒有 生物學(xué)活性，而是經(jīng)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin ConvertingEmzyme, ACE)剪切C-末 端兩個(gè)氨基酸殘基而形成A II。A II具有高效的收縮血管作用，從而使血壓升高。A II也能 刺激腎上腺皮質(zhì)分泌ALD，ALD能促進(jìn)腎臟對(duì)水和鈉離子的重吸收，繼而增加體液容量，升 高血壓。
[0003] 此外，體內(nèi)的鈉、鉀水平，促腎上腺皮質(zhì)激素，腎上腺素能及多巴胺能系統(tǒng)對(duì)ALD 的分泌也有調(diào)節(jié)作用。在體內(nèi)，血ALD主要和血漿白蛋白結(jié)合，而很少和皮質(zhì)類固醇結(jié)合球 蛋白（CBG)結(jié)合，因此，具有相對(duì)較短的半衰期（約35min)及較高的代謝清除率。尿液中 含有未經(jīng)代謝的ALD約占分泌量的6%左右，且具有激素活性。
[0004] 目前，臨床上測(cè)定ALD的方法主要有放射性免疫法、酶聯(lián)免疫法等。例如，北京北 方生物技術(shù)研宄所生產(chǎn)的碘[125I]ALD放射免疫分析藥盒采用競(jìng)爭(zhēng)法原理測(cè)定血漿及尿中 的ALD含量。加入樣本和兔抗-ALD抗體（藍(lán)色）及 125I-ALD標(biāo)記物（紅色）后，125I-ALD 標(biāo)記物與樣本中的ALD競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合兔抗-ALD抗體，混勻，2-8°C放置過夜（16-24小時(shí)），加入 驢抗兔免疫分離劑，充分搖勻后，室溫放置15min，3000轉(zhuǎn)/分離心15min，去上清，測(cè)沉淀 管的放射性計(jì)數(shù)（cpm)。樣本中的ALD濃度依據(jù)由校準(zhǔn)品濃度和對(duì)應(yīng)的放射性計(jì)數(shù)建立的 Log-Logit數(shù)學(xué)模型進(jìn)行定量，從而檢測(cè)樣本中的ALD含量。
[0005] 然而，放射性免疫法及酶聯(lián)免疫法存在諸多不足。例如，上述放射性免疫法存在放 射性污染、標(biāo)記物半衰期短、對(duì)操作者具有放射性損傷，且操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，靈敏度低，檢 測(cè)范圍窄，且不能實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化的缺陷。傳統(tǒng)的放射性免疫法或酶聯(lián)免疫法方法檢測(cè)時(shí)間 長(zhǎng)，同時(shí)主要依靠純手工加樣等系列繁瑣操作，效率低，容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差大；由于酶 促反應(yīng)不夠徹底，且易受外部干擾因素影響，如溫度、時(shí)間及材料濃度影響，因此檢測(cè)時(shí)特 異性低，靈敏度差，檢測(cè)范圍窄。因此，本領(lǐng)域亟需一種在獲得高靈敏度的同時(shí)提高檢測(cè)試 劑的檢測(cè)準(zhǔn)確性、安全性和穩(wěn)定性，操作更加簡(jiǎn)便，還能夠借助分析儀器實(shí)現(xiàn)檢測(cè)過程全自 動(dòng)化的檢測(cè)ALD的檢測(cè)試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)ALD的 化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，以獲得高的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性，還能提高檢測(cè)試劑的穩(wěn)定性， 延長(zhǎng)檢測(cè)試劑的保存時(shí)間。
[0007] 本發(fā)明還提供用于檢測(cè)ALD的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的制備方法。
[0008] 另外，本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明提供的ALD化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用， 尤其是采用所述試劑盒，通過全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行ALD檢測(cè)的方法，減少操作時(shí)間，降低 人為操作誤差，同時(shí)利用化學(xué)示蹤標(biāo)記物的特異性，提高檢測(cè)靈敏度。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明，提供了一種用于檢測(cè)醛固酮的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，所述試劑 盒包括醛固酮抗原和抗醛固酮抗體，所述醛固酮抗原和抗醛固酮抗體中的一種標(biāo)記示蹤標(biāo) 記物，另一種包被磁球。
[0010] 應(yīng)理解，在本發(fā)明提供的上述試劑盒中，所述抗醛固酮抗體可以是一種或多種抗 醛固酮單克隆抗體和/或抗醛固酮多克隆抗體。實(shí)際上，在本發(fā)明中所提及的抗體都可以 是單克隆抗體和/或多克隆抗體。
[0011] 值得注意的是，在本發(fā)明中，如無特別說明，醛固酮抗原是指單獨(dú)的醛固酮抗原或 單獨(dú)的醛固酮抗原與蛋白載體的連接物。其中，所述蛋白載體可以選自本領(lǐng)域常用的蛋白 載體中的至少一種。例如，所述蛋白載體選自牛血清白蛋白（BSA)、人血清白蛋白（HSA)、兔 血清白蛋白（RSA)、血藍(lán)蛋白（KLH)、牛IgG、人IgG、卵清蛋白（OVA)、肌紅蛋白和甲狀腺球蛋 白中的至少一種。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明，所述示蹤標(biāo)記物可以選自本領(lǐng)域中常用于標(biāo)記抗原或抗體的示蹤標(biāo) 記物，例如選自金剛烷、魯米諾及其衍生物、異魯米諾及其衍生物、吖啶酯、堿性磷酸酶和辣 根過氧化物酶中的至少一種，優(yōu)選為N-(4-氨丁基）-N-乙基異魯米諾（ABEI)。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明，所述示蹤標(biāo)記物直接標(biāo)記或者間接標(biāo)記ALD抗原或抗ALD抗體。其 中，間接標(biāo)記包括但不限于通過異硫氰酸熒光素（FITC)與抗FITC抗體體系或鏈霉親和素 (SA)與生物素（Biotin)體系間接標(biāo)記ALD抗原或抗ALD抗體。所述"直接標(biāo)記"是指示蹤 標(biāo)記物直接與醛固酮抗原或針對(duì)待測(cè)抗原的抗體連接進(jìn)行標(biāo)記；所述"間接標(biāo)記"是指通過 中間媒介鏈接體系使得示蹤標(biāo)記物標(biāo)記ALD抗原或抗ALD抗體，所述中間媒介鏈接體系包 括但不限于FITC與抗FITC抗體體系或鏈霉親和素與生物素體系。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，間接標(biāo) 記有利于減弱空間效應(yīng)，有利于信號(hào)的放大，使得檢測(cè)更加靈敏。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明，ALD抗原或抗ALD抗體直接包被磁球，或者通過FITC與抗FITC抗體 體系或鏈霉親和素與生物素體系間接包被磁球。所述"直接包被"是指利用ALD抗原或抗 ALD抗體直接對(duì)磁球進(jìn)行包被；所述"間接包被"是指通過中間媒介鏈接體系，使得ALD抗原 或抗ALD抗體對(duì)磁球進(jìn)行包被，所述中間媒介鏈接體系包括但不限于FITC與抗FITC抗體 體系或鏈霉親和素與生物素體系。同樣，間接包被的優(yōu)點(diǎn)在于，有利于減弱空間效應(yīng)，有利 于信號(hào)的放大，使得檢測(cè)更加靈敏。
[0015] 適用于本發(fā)明的磁球也成為磁珠，可以是本領(lǐng)域中常用的磁性微球。優(yōu)選的是，本 發(fā)明使用的磁球，是將納米級(jí)的Fe2O3或Fe3O4磁性粒子和有機(jī)高分子材料進(jìn)行復(fù)合，形成具 有超順磁性和極大量蛋白吸附容量的微米級(jí)的固相微球，具有在外加磁場(chǎng)作用下可迅速被 磁化，在撤走磁場(chǎng)后剩磁為零的屬性。其中，所述有機(jī)高分子材料的種類沒有特別限制，可 根據(jù)需要進(jìn)行選擇。
[0016] 本發(fā)明所使用的磁性微球應(yīng)能滿足直徑為0. 1-5 μ m，磁性微球還可以通過表面改 性而帶有多種活性功能基團(tuán)，包括但不限于-OH、-C00H、-NH2。
[0017] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述磁球?yàn)镕e2O3或Fe 304磁性納米粒子與有機(jī)高分子材料 的復(fù)合體，并具有〇. 1-5 μ m的粒徑；并且，所述磁球任選地通過表面改性而帶有多種活性 功能基團(tuán)。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述試劑盒包括選自組分Al和組分A2中的任意一 種的組分，以及選自組分B1、組分B2和組分B3中的任意一種的組分；其中，組分Al為ABEI 直接標(biāo)記的ALD抗原；組分A2為鏈霉親和素標(biāo)記的ABEI和生物素化的ALD抗原；組分Bl 為抗ALD抗體直接包被的磁球；組分B2為生物素化的抗ALD抗體和鏈霉親和素包被的磁 球；以及組分B3為抗ALD抗體標(biāo)記的FITC和抗FITC抗體包被的磁球。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施方案，所述試劑盒包括選自組分Cl和組分C2中的任意 一種的組分，以及選自組分Dl、組分D2和組分D3中的任意一種的組分；其中，組分Cl為 ABEI直接標(biāo)記的抗ALD抗體；組分C2為鏈霉親和素標(biāo)記的ABEI和生物素化的抗ALD抗體； 組分Dl為ALD抗原直接包被的磁球；組分D2為生物素化的ALD抗原和鏈霉親和素包被的 磁球；以及組分D3為ALD抗原標(biāo)記的FITC和抗FITC抗體包被的磁球。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明，所述試劑盒還可以包括ALD的低點(diǎn)校準(zhǔn)品和高點(diǎn)校準(zhǔn)品，并任選地 包括緩沖液。本發(fā)明所述低點(diǎn)校準(zhǔn)品與高點(diǎn)校準(zhǔn)品是兩者相對(duì)而言，其中"低點(diǎn)校準(zhǔn)品"，是 指將ALD抗原用50%牛血清制品稀釋成濃度為20-120pg/ml得到的校準(zhǔn)品；而"高點(diǎn)校準(zhǔn) 品"是指將八〇)抗原用50%牛血清制品稀釋成濃度為800-1600?8/1111得到的校準(zhǔn)品。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明提供的試劑盒，所包含的各成分濃度優(yōu)選如下：ALD抗原 為 0· 002-0. 01mg/ml ;抗 ALD 抗體為 0· 05-lmg/ml ;磁球?yàn)?0· 05-lmg/ml ;FITC 為 0. 002-0.01mg/ml ;抗 FITC 抗體為 0.05-lmg/ml ;鏈霉親和素為 0.05-lmg/ml ;生物素為 0· 002-0. 01mg/ml ;示蹤標(biāo)記物為0· 2-lmg/l ;以及如果使用了蛋白載體，其濃度為2-10mg/ 1。 上述各成分的濃度均基于包含該成分的單獨(dú)的試劑盒組分的量計(jì)。
[0022] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，在本發(fā)明的試劑盒中，在ALD抗原上標(biāo)記ABEI，并用 抗ALD抗體包被磁球。
[0023] 例如，在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述試劑盒包括ALD抗原標(biāo)記的ABElJA ALD抗體包被的磁球、低點(diǎn)校準(zhǔn)品和高點(diǎn)校準(zhǔn)品。
[0024] 例如，在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述試劑盒包括ALD抗原標(biāo)記的ABEI、生 物素化的抗ALD抗體、鏈霉親和素包被的磁球、低點(diǎn)校準(zhǔn)品和高點(diǎn)校準(zhǔn)品。
[0025] 例如，在本發(fā)明的一個(gè)具體