一種分析微生物油脂組成的方法
【專利說明】
[0001]
技術領域
[0002] 本發(fā)明涉及一種分析微生物油脂組成的方法。
【背景技術】
[0003] 微生物油脂又稱單細胞油脂，是由酵母、霉菌、藻類等真核微生物在一定條件下利 用碳源、氮源、輔以無機鹽生產(chǎn)所得到的油脂。早在130多年前，人們就開始了對產(chǎn)脂微生 物的研究，經(jīng)過漫長的研究開發(fā)，如今微生物油脂已經(jīng)從學術性研究領域跨入嬰幼兒奶粉 配方市場，成功地完成了從實驗室研究到商業(yè)化的重要轉變。
[0004] 微生物油脂中存在多種不飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸主要包括單不飽和脂肪酸和 多不飽和脂肪酸，它們均對人體健康有很大益處。根據(jù)第一個雙鍵位置的不同，多不飽和 脂肪酸可以分為ω-3、ω-6和ω-9三種類型。一些國家的科研機構建議，人們攝入的多 不飽和脂肪酸至少應占攝入總脂的3%，應提高膳食中ω-3型多不飽和脂肪酸的比例。其 中，二十二碳六烯酸（DHA)屬ω-3型多不飽和脂肪酸，具有多種重要的生理功能，是視網(wǎng) 膜組織中細胞膜的組成成分，對嬰幼兒視覺和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育有至關重要的作用；同時它 在預防高血壓、動脈硬化、關節(jié)炎以及癌癥等疾病方面具有顯著功效。花生四烯酸(ARA)屬 于ω-6型多不飽和脂肪酸，是細胞膜的重要成分和前列腺素等生理活性物質(zhì)的前體，具有 促進嬰幼兒腦部發(fā)育，提高青少年記憶力等功效，還可以調(diào)節(jié)血脂血糖，抑制腫瘤。世界衛(wèi) 生組織（WHO)和國際糧農(nóng)組織委員會（FAO)在報告中推薦嬰兒每日應攝食60 mg ARA (每 公斤嬰兒體重)。如果膳食營養(yǎng)不均衡導致人體內(nèi)ARA缺乏，這時需要適當補充ARA維持人 體正常生理活動。
[0005] 微生物油脂中主要成分是甘油酯，甘油酯分為甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯，一 般情況下甘油三酯占甘油酯總量的80%以上。通過LC-MS技術對甘油酯組成進行解析，可 以獲得微生物代謝產(chǎn)物的數(shù)據(jù)庫，建立檢測油脂微生物中脂質(zhì)變化的代謝分析平臺，從而 調(diào)控細胞生長和脂質(zhì)積累的內(nèi)在代謝機制，為微生物油脂的工業(yè)化生產(chǎn)提供科學指導。
[0006] 甘油酯的分析方法國內(nèi)外已經(jīng)有相關的研究，如化學法（高碘酸法測單甘酯）、薄 層色譜（TCL)、氣相色譜、高效液相色譜等分析方法。然而，化學法、薄層色譜只能簡單定性， 無法定量分析甘油酯的組成；氣相色譜法對甘油一酯、甘油二酯可進行定性和定量的分析， 而甘油三酯由于其分子量比較大，沸點比較高，因此甘油三酯的氣相色譜分析是十分困難 的。
[0007] 孟祥河等人報道了使用正相高效液相色譜和蒸發(fā)光散射檢測器測定和分離甘油 一酯、二酯和三酯化合物，然而，這種分析僅僅適用于油酸酯和亞油酸酯的分析和分離，不 能用于不同脂肪酸組成的甘油酯的分離。
[0008] 中國公開號為CN103743851A的專利研究了一種食用油中甘油三酯的單柱二維液 相色譜-質(zhì)譜分析方法，該專利能檢測甘油三酯，但是并沒有提到甘油一酯、二酯的定性和 定量分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種新的、能全面分析油脂組成的分析微生物油脂組成的方 法。
[0010] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的分析微生物油脂組成的方法，具體步驟包括：（1)將產(chǎn) 油微生物發(fā)酵，獲得含有微生物油脂的菌體，從菌體中提取微生物油脂；（2)將微生物油脂 進樣至質(zhì)譜，對其進行全掃描，掃描范圍為100-1000 ;(3)對各母離子進行MS2掃描，質(zhì)譜條 件為DP:40-80，CE:35-50;(4)對樣品進行中性丟失掃描，結合步驟（3)確定MRM方法， 對樣品進行定性分析；（5)向樣品中加入內(nèi)標，以采集方式為MRM進行分段跑樣，其中甘油 一酯和甘油二酯為一段，甘油三酯為另一段，通過對各自的離子色譜圖進行積分，計算出各 組分的含量，進行定量分析；以上步驟中，使用以下儀器條件：色譜條件：進樣量：20μ 1 ; 色譜柱：（：18色譜柱4.6父150,311111;流動相：六異丙醇，8甲醇，柱溫201：，流速0.8 ml ,/mi η ;洗脫梯度為 Omin = 80%B ;6min = 80%Β ;6 ~13min = 60%Β ; 13 ~25min=80%B, 其中異丙醇和甲醇為色譜純；質(zhì)譜條件：AB 4500QTRAP串聯(lián)四極桿離子阱質(zhì)譜儀，高壓放 電針電流：8μΑ，樣品錐孔電壓：5V，源溫度：130°C，APCI加熱器溫度：500°C，脫溶劑氣流 量：300L/h，錐孔氣流量：100L/h ;儀器參數(shù)：離子源：Turbo V，電離模式：APCI正離子 模式；MRM參數(shù)：DP=40-80; CE=35-50,每對離子對掃描時間為3ms。
[0011] 本發(fā)明的分析微生物油脂組成的方法，采用LC-MS及C18反相柱，通過梯度洗脫可 以快速、高效、全面地對樣品中的甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯的進行定性及定量分析。
【附圖說明】
[0012] 圖1為實施例ARA油脂中甘油一酯和甘油二酯LC-MS總離子流圖； 圖2為實施例ARA油脂中甘油三酯LC-MS總離子流圖。
[0013] 以下結合具體實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容。
【具體實施方式】
[0014] 實施例1:使用高山被孢霉制備微生物油脂 a)孢子懸浮液準備：取高山被孢霉(保藏編號：CCTCC M2013419)。將菌種培養(yǎng)7天至 孢子成熟，然后進行液體深層培養(yǎng)。
[0015] b)種子瓶培養(yǎng)：將馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA)培養(yǎng)基平板上的孢子和菌絲刮到裝有 10毫升無菌水，5顆3毫米直徑玻璃珠的錐形瓶中，錐形瓶置于200轉/分鐘的搖床上震蕩 10分鐘，然后將孢子懸液接入到種子瓶中，接種量10% (體積比)，種子瓶置于25°C，120轉 /分鐘的搖床上培養(yǎng)36小時，所述種子培養(yǎng)用到的培養(yǎng)基為：碳源為葡萄糖20 g/Ι ;氮源 為：酵母粉5 g/1 ;pH 5.5。
[0016] C)發(fā)酵瓶培養(yǎng)：種子瓶中菌濃達到15%，接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量10% (體積 比)，發(fā)酵瓶置于25°C，120轉/分鐘的搖床上培養(yǎng)9天。所述發(fā)酵培養(yǎng)基為：碳源為葡萄糖 50 g/Ι ;氮源為：酵母粉 10 g/1 ;pH 5. 5。
[0017] d)微生物油制備：液體深層培養(yǎng)后分離并得到含有一定水份的菌體，取濕菌體 5g，放入研磨器中，同時加入5ml正己燒，充分研磨3min，過濾得到固相物轉入到研磨器中 再次進行研磨，直到溶劑中無顏色，收集每次研磨后過濾分離得到的微生物油脂和溶劑的 混合液，脫溶，得到微生物油脂。
[0018] 實施例2:使用三孢布拉氏霉制備微生物油脂 a) 菌種活化：無菌環(huán)境下將三孢布拉霉正負菌株分別接種到斜面PDA培養(yǎng)基中， 置于培養(yǎng)箱內(nèi)，27°C培養(yǎng)5d，待三孢布拉霉正負菌株分別長出孢子后，在無菌條件下，用無 菌生理鹽水將斜面培養(yǎng)基中孢子刮洗下來，并配制成均勻的孢子懸液，使正負菌孢子懸液 的濃度分別達到：1〇 3~1〇6個孢子/mL，負菌103~106個孢子/mL; b) 種子培養(yǎng)：正負菌分別以孢子懸液的方式接種到種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基裝在 1000 mL的三角瓶中，裝液量100~150mL，培養(yǎng)溫度為27°C，轉速220~250 r/min，正、負菌 培養(yǎng)時間為18~ 24小時，得到三孢布拉霉正負菌株種子液； c) 發(fā)酵培養(yǎng)：達到對數(shù)生長期的正負菌種子液按1:7~1:20的比例在無菌的條件下 混合，再以5%-25%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)90~120h ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配制方 法為：碳源為葡萄糖或淀粉；氮源為酵母粉和/或豆餅粉和/或大豆粉和/或玉米粉；無機 鹽為磷酸二氫鉀、磷酸二氫鉀；植物油為：葵花籽油和/或豆油和/或棉籽油； d) 培養(yǎng)條件：溫度：27°C ±1°C ;轉速：250~500 r/min ;風量：l~3vvm ;溶氧控制：15% 以上；周期：90h~120h。過程中根據(jù)溶氧先調(diào)節(jié)通氣量至最大，培養(yǎng)一段時間后，溶氧再次 降低至15%以下，此時調(diào)整罐壓至最大，約0. lMpa~0. 16Mpa，此后逐步增加轉速至最高500 r/min〇
[0019] e)微生物