一種同時(shí)定量檢測多個(gè)受體的抗體芯片試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種同時(shí)定量檢測多個(gè)受體的抗體芯片 試劑盒。 技術(shù)背景
[0002] 受體（receptor)是一種能與細(xì)胞外專一信號(hào)分子（配體）結(jié)合引起細(xì)胞反應(yīng)的蛋 白質(zhì)。
[0003] 受體分為細(xì)胞表面受體和細(xì)胞內(nèi)受體。受體與配體結(jié)合即發(fā)生分子構(gòu)象變化，從 而引起細(xì)胞反應(yīng)，如介導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞間黏合、細(xì)胞胞吞等細(xì)胞過程。受體在細(xì)胞 膜上或細(xì)胞內(nèi)能識(shí)別生物活性分子并與之結(jié)合，把識(shí)別和接受的信號(hào)正確無誤地放大并傳 遞到細(xì)胞內(nèi)部，從而激活或啟動(dòng)一系列生物化學(xué)反應(yīng)，最后導(dǎo)致該信號(hào)物質(zhì)特定的生物效 應(yīng)。通常受體具有兩個(gè)功能：一是識(shí)別特異的信號(hào)物質(zhì)一配體，識(shí)別的表現(xiàn)在于兩者結(jié)合。 配體，是指這樣一些信號(hào)物質(zhì)，除了與受體結(jié)合外本身并無其他功能，它不能參加代謝產(chǎn)生 有用產(chǎn)物，也不直接誘導(dǎo)任何細(xì)胞活性，更無酶的特點(diǎn)，它唯一的功能就是通知細(xì)胞在環(huán)境 中存在一種特殊信號(hào)或刺激因素；二是把識(shí)別和接受的信號(hào)準(zhǔn)確無誤的放大并傳遞到細(xì) 胞內(nèi)部，啟動(dòng)一系列胞內(nèi)生化反應(yīng)，最后導(dǎo)致特定的細(xì)胞反應(yīng)，促進(jìn)祀細(xì)胞的增殖和分化， 增強(qiáng)抗感染和殺腫瘤細(xì)胞效應(yīng)，促進(jìn)或抑制細(xì)胞因子的合成，促進(jìn)炎癥過程，影響細(xì)胞代謝 等。
[0004] 受體研究具有非常重要的理論和實(shí)用意義，它從分子水平來闡明激素、遞質(zhì)、藥 物、抗體的作用機(jī)制及生理和病理過程的，已成為科學(xué)技術(shù)的前沿陣地之一。
[0005] 目前常用的受體檢測方法主要包括：酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)，放射免疫分析 (radioimmunoassay，RIA)，免疫印跡法（western blot)，流式細(xì)胞儀（Flow-Cytometry)等。 其中，酶聯(lián)免疫吸附法是最普遍的方法，具靈敏度高、特異性較好、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。但一次 試驗(yàn)只能檢測單一指標(biāo)，通量低、成本高，在具有多指標(biāo)特性的受體檢測中，該方法存在明 顯的不足；放射免疫分析（RIA)雖然靈敏度高，是由于具有放射性污染，現(xiàn)在已很少采用； 免疫印跡法能測定分子的大小，且無非特異的反應(yīng)，但操作繁瑣，靈敏度低，且只能檢測單 一指標(biāo)，不適合運(yùn)用于受體的檢測；流式細(xì)胞儀能在細(xì)胞水平上檢測受體的水平，但卻存在 低靈敏、低通量、高成本等缺點(diǎn)。
[0006] 有鑒于此，有必要開發(fā)一種新型的多種受體定量檢測試劑盒，以克服現(xiàn)有技術(shù)中 亟待解決的問題，實(shí)現(xiàn)多種受體的高通量、高靈敏度、高特異性和低成本檢測。在本發(fā)明中， 我們選用沒有空間限制的標(biāo)準(zhǔn)組織玻片作為載體，可使點(diǎn)在同一微陣列上檢測受體的數(shù)目 可以不受空間的限制。由于玻片具有非常低的自身熒光，而且熒光信號(hào)不具擴(kuò)散性，不同點(diǎn) 間的熒光信號(hào)不會(huì)彼此干擾，所以一次可以同時(shí)檢測幾十個(gè)受體。本發(fā)明采用抗體夾心法 原理在玻片表面進(jìn)行多重ELISA反應(yīng)，不僅一次可以檢測多達(dá)幾十個(gè)受體，并且所檢測的 受體靈敏度可達(dá)單因子的ELISA檢測靈敏度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種同時(shí)定量檢測多個(gè)受體的抗體 芯片試劑盒，能在標(biāo)準(zhǔn)組織玻片上進(jìn)行高通量、高靈敏度、高特異性和低成本的受體定量檢 測。
[0008] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所述的一種定量檢測多個(gè)受體的抗體芯片試劑 盒，包括：抗體芯片，包括標(biāo)準(zhǔn)組織玻片和在玻片表面上固定的40種受體的特異性抗體、兩 種陽性對(duì)照；四個(gè)所述的抗體芯片放于與常規(guī)96孔酶標(biāo)板尺寸相符的芯片固定框上進(jìn)行 標(biāo)準(zhǔn)ELISA系統(tǒng)的自動(dòng)化操作；受體標(biāo)準(zhǔn)品混合物，是將40種受體標(biāo)準(zhǔn)品按照一定的量混 合在一起的凍干混合物；生物素標(biāo)記的受體檢測抗體混合物；和熒光染料Cy3標(biāo)記的鏈霉 親和素。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明所述的抗體芯片試劑盒的進(jìn)一步特征，所述的標(biāo)準(zhǔn)組織玻片是用活性 氨基包被處理。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明所述的抗體芯片試劑盒的進(jìn)一步特征，所述的標(biāo)準(zhǔn)組織玻片是用非接 觸性點(diǎn)樣儀將多種抗原特異性抗體點(diǎn)成2X8個(gè)相同的抗體微陣列，并用相配套可拆裝的 2X8孔框架把微陣列分割在16個(gè)互不干擾的小區(qū)內(nèi)；玻片和框架之間通過兩側(cè)的邊框夾 緊扣形成抗體芯片。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明所述的抗體芯片試劑盒的進(jìn)一步特征，所述框架是由三部分組成：上 層塑料框架、下層乳膠封閉框和兩側(cè)的邊框夾；乳膠封閉框通過高透明雙面膠貼于表面點(diǎn) 有微陣列的玻片上，乳膠封閉框的另一面貼上塑料框架，再用邊框夾將它們兩邊夾緊，形成 孔間互不交叉污染的反應(yīng)器，如圖1所示。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明所述的抗體芯片試劑盒的進(jìn)一步特征，所述的抗體芯片是用濃度分別 為200ug/ml的40種抗體點(diǎn)樣；每種抗體是用含有0. 01-10g/100ml牛白蛋白的特異性PBS 緩沖液配制；每個(gè)抗體在每個(gè)微陣列中有四次的重復(fù)點(diǎn)樣，以致從單一微陣列中得到該受 體四倍于ELISA的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。所述點(diǎn)樣是采用全自動(dòng)點(diǎn)樣儀完成點(diǎn)樣操作，使各特異性抗 體獨(dú)立排布于所述玻片。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明所述的抗體芯片試劑盒的進(jìn)一步特征，所述特異性抗體為選自針對(duì)如 下受體的抗體：腫瘤壞死因子受體4-1BB、白細(xì)胞活化黏附因子、刺激分子B7-1、B細(xì)胞成熟 因子、髓系細(xì)胞特異性富含亮氨酸糖蛋白、腫瘤壞死因子受體CD30 ;腫瘤壞死因子配體-5、 癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子1、死亡受體6、酪氨酸激酶、細(xì)胞膜糖蛋白、受體型酪氨酸激酶 ErbB3、E-選擇素、腫瘤壞死因子受體超家族成員6、人FMS樣酪氨酸激酶3配體、糖皮質(zhì) 激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體家族相關(guān)蛋白、皰疹病毒侵入介體、細(xì)胞間黏附分子3、白介 素-1受體4、白介素-1受體1、白介素-2受體γ、白介素-10受體β、白介素-17受體、白 介素-21受體、溶酶體膜蛋白2、載脂蛋白-2、L-選擇素、淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體1、主要 組織相容性復(fù)合物I類鏈相關(guān)蛋白Α、主要組織相容性復(fù)合物I類鏈相關(guān)蛋白Β、紐蘭格林 蛋白1受體1、血小板衍生生長因子受體、血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子1、人類晚期糖化終產(chǎn)物 受體、細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白1、腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體、Trappin-2蛋白、尿激 酶型纖溶酶原激活劑受體、血管細(xì)胞粘附分子、X性連鎖外胚層發(fā)育不良-A2受體。上述各 種特異性抗體分別點(diǎn)樣于所述玻片形成若干個(gè)獨(dú)立識(shí)別位點(diǎn)。每個(gè)獨(dú)立識(shí)別位點(diǎn)上分別固 定有單一濃度的一種特異性抗體。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明所述的抗體芯片試劑盒的進(jìn)一步特征，所述點(diǎn)樣包括：將100-1000pl 特異性抗體蛋白質(zhì)的PBS緩沖液(含有0.01-10g/100ml牛白蛋白）點(diǎn)樣于所述玻片上，將點(diǎn) 樣好的玻片放于室溫條件下靜置過夜，于2-8°C保存?zhèn)溆谩?br>[0015] 本發(fā)明采用不同的特異性抗體作為定量檢測受體的探針，這些抗體之間的性質(zhì)差 異大，穩(wěn)定性也差，為了確保制備芯片的抗體具有較高的純度和完好的生物活性，本發(fā)明采 用了合適的點(diǎn)樣液，即含有0. 01-10g/100ml牛白蛋白的PBS緩沖液，來溶解抗體。實(shí)驗(yàn)表 明，該點(diǎn)樣液可有效防止抗體變性，從而維持其生物活性。
[0016] 現(xiàn)有的檢測芯片，點(diǎn)樣后處理通常包括水合、紫外交聯(lián)、洗脫、封閉等步驟。由于本 發(fā)明所采用優(yōu)良的點(diǎn)樣液，使得抗體芯片制備的步驟等到了極大的簡化，無需現(xiàn)