定量檢測人附睪分泌蛋白-4的熒光免疫層析試劑盒及其制備方法
【專利說明】定量檢測人附睪分泌蛋白-4的熒光免疫層析試劑盒及其制備方法
[0001]
技術領域
[0002]本發(fā)明涉及醫(yī)學檢驗領域中的癌癥臨床免疫診斷試劑盒領域，具體涉及定量檢測人附睪分泌蛋白-4的熒光免疫層析試劑盒。
【背景技術】
[0003]卵巢癌是發(fā)生于卵巢組織，至今尚未明確發(fā)病機制的惡性腫瘤，是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅低于宮頸癌與宮體癌，死亡率相對較高。卵巢癌早期臨床癥狀不典型、客觀，與卵巢良性腫瘤很難區(qū)分，缺乏早期診斷的有效方法，患者往往錯過治療的最佳時機。因此，卵巢癌成為嚴重威脅婦女健康的重大疾患之一。
[0004]由于卵巢的胚胎發(fā)育及內分泌功能復雜，術前鑒別卵巢腫瘤組織類型相當困難。到目前為止，就國內外的臨床資料統(tǒng)計來看，I期卵巢癌患者的5年生存率為90%，而晚期卵巢癌患者的5年生存率僅為30%。因此，如果能及早檢出卵巢癌，可以大大降低卵巢癌患者的死亡率，延長其生存時間。目前卵巢癌的診斷檢測方法主要有兩種。一種是經(jīng)陰道超聲檢查(TUV)，可用于檢查女性的生殖器官，包括子宮、卵巢、宮頸及陰道，目前應用較為普遍，但其缺點在于無法區(qū)分腫塊是惡性還是良性，而且其主要依靠醫(yī)師的經(jīng)驗進行判斷，局限性很大。另一種檢測方法是檢查腫瘤標志物CA125，被視為卵巢癌診斷的“金標準”，但是CA125特異性及敏感度較低，臨床上通過CA125診斷卵巢癌的假陽性率較高，如乳腺癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、肺癌均可能為陽性，另外，在生理條件下(如月經(jīng)期、妊娠期)尤其可能出現(xiàn)陽性，從而導致卵巢癌的誤診率較高，而且單用CA125診斷卵巢癌的陽性率小于10%，即使聯(lián)合其他檢測手段如超聲檢查，陽性率也只能提高到20%。綜上，目前臨床上診斷卵巢癌依舊缺乏敏感性和特異性均較高的腫瘤生物學指標。因此，臨床中迫切需要更加敏感有效的腫瘤標志物與CA125互補。
[0005]申請?zhí)枮?01410164258.5的中國發(fā)明專利申請公開了一種卵巢癌快速診斷試劑盒的制備方法，主要基于微量滴定板(如96孔板、384孔板)進行分析，靈敏度高，但是操作復雜，反應時間長，成本高。而且如果樣本量比較少，則需要等待，從而無法滿足基層醫(yī)院，包括縣級及鄉(xiāng)鎮(zhèn)醫(yī)院的需求。
【發(fā)明內容】
[0006]本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)有技術中卵巢癌診斷存在的不足，提供一種基層醫(yī)院到三甲醫(yī)院均適用的、靈敏度高、準確性強、操作簡便、能夠快速診斷早中期卵巢癌的診斷試劑盒。
[0007]為解決上述技術問題，本發(fā)明采用熒光免疫層析技術，以人附睪分泌蛋白-4 (human epididymis secretory protein 4，HE4)作為檢測指標，具體的技術方案為:
[0008]本發(fā)明的一個方面提供了一種定量檢測人附睪分泌蛋白-4的熒光免疫層析試劑盒，包括扣卡(11)、熒光免疫層析試紙條和緩沖液，其中，扣卡(11)為熒光免疫層析試紙條的外部殼結構，包括加樣孔(9)和觀察窗(10)，如圖3所示。
[0009]熒光免疫層析試紙條結構如圖1和圖2所示，包括樣品墊(1)、標記墊(2)、層析膜
(6)、吸水墊(7)和底板(8)。當進行全血樣品檢測時，試紙條還包括血液分離膜(3)。其中，樣品墊(I)、標記墊(2)、血液分離膜(3)、層析膜(6)和吸水墊(7)搭載于底板(8)之上，樣品墊(I)位于加樣孔(9)的下方，且連接于標記墊(2)，標記墊(2)連接于層析膜(6)，層析膜(6)連接于吸水墊(7)，其上固定有一條定量檢測線(4)和一條質控線(5)，優(yōu)選二者距離3mm?8mm，并位于觀察窗(10)的下方。在包括血液分離膜(3)的情況下，血液分離膜
(3)設置在標記墊(2)和層析膜(6)之間，此時標記墊(2)連接于血液分離膜(3)，血液分離膜(3)連接于層析膜￠)，或者血液分離膜(3)設置在樣品墊(I)和標記墊(2)之間，此時樣品墊(I)連接于血液分離膜(3)，血液分離膜(3)連接于標記墊(2)，或者血液分離膜
(3)直接與樣品墊(I)合并為同一結構。
[0010]標記墊(2)上同時固定有熒光染料修飾的人附睪分泌蛋白-4特異性抗體，和熒光染料修飾的質控分子，修飾人附睪分泌蛋白-4特異性抗體的熒光染料的發(fā)射波長與修飾質控分子的熒光染料的發(fā)射波長相同，波長范圍為300-1300nm。
[0011]定量檢測線(4)上固定有人附睪分泌蛋白-4特異性抗體，該特異性抗體所識別的抗原決定簇與固定在標記墊(2)上的熒光染料修飾的人附睪分泌蛋白-4特異性抗體所識別的抗原決定簇不同。
[0012]質控線(5)上固定有能與質控分子特異性結合的生物分子。
[0013]本發(fā)明的另一個方面提供了上述定量檢測人附睪分泌蛋白-4的熒光免疫層析試劑盒的制備方法，包括如下步驟:
[0014]步驟⑴:用化學交聯(lián)或生物分子間特異性作用分別將熒光染料偶聯(lián)到人附睪分泌蛋白-4特異性抗體和質控分子的表面，分別得到熒光染料修飾的人附睪分泌蛋白-4特異性抗體和熒光染料修飾的質控分子，修飾所述質控分子的熒光染料的發(fā)射波長與修飾人附睪分泌蛋白-4特異性抗體的熒光染料的發(fā)射波長相同，波長范圍為300?1300nm ;
[0015]步驟(2):將步驟(I)得到的熒光染料修飾的人附睪分泌蛋白-4特異性抗體和熒光染料修飾的質控分子均固定到標記墊(2)上；
[0016]步驟(3):在層析膜(6)上分別設置一條定量檢測線⑷和一條質控線(5)，其中，質控線(5)上固定有能與質控分子特異性結合的生物分子，定量檢測線(4)上固定有人附睪分泌蛋白-4特異性抗體，且該特異性抗體所識別的抗原決定簇與固定在標記墊(2)上的熒光染料修飾的人附睪分泌蛋白-4特異性抗體所識別的抗原決定簇不同；
[0017]步驟(4):將樣品墊(I)、標記墊(2)、層析膜(6)、吸水墊(7)和底板(8)構建成熒光免疫層析試紙條，當進行全血樣品檢測時，試紙條還包括血液分離膜(3);
[0018]步驟(5):將熒光免疫層析試紙條裝卡。
[0019]本發(fā)明采用化學交聯(lián)或生物分子間特異性作用將熒光染料偶聯(lián)到人附睪分泌蛋白-4特異性抗體的表面或質控分子的表面，分別得到熒光染料修飾的人附睪分泌蛋白-4特異性抗體和熒光染料修飾的質控分子。在本發(fā)明中，當熒光染料表面存在活性基團時，可將其直接與特異性抗體反應，不需用化學交聯(lián)劑；反之，則需通過化學交聯(lián)劑將熒光染料與人附睪分泌蛋白-4特異性抗體或質控分子相偶聯(lián)。其中，化學交聯(lián)劑包括1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)及戊二醛等。
[0020]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，采用有活性基團的熒光染料修飾人附睪分泌蛋白-4特異性抗體或質控分子，步驟為:將純化后的熒光染料溶解，然后加入一定量的人附睪分泌蛋白-4特異性抗體或質控分子，以緩沖液作為反應介質，反應2?4小時，加入鹽酸羥胺終止反應，用色譜、層析柱或超濾離心等方式純化，得到熒光染料修飾的人附睪分泌蛋白-4特異性抗體或質控分子。
[0021]為了提高信號與背景的區(qū)分度，本發(fā)明中熒光染料的波長范圍為300?1300nm，優(yōu)選為550-800nm。這是因為，在紫外照射下，層析膜、底板和扣卡的熒光強度在550nm以下會遠強于550nm以上，從而會對低濃度人附睪分泌蛋白_4的檢測產(chǎn)生一定的影響，故優(yōu)選發(fā)射波長大于550nm的焚光染料；此外，層析膜、底板和扣卡一般在近紅外區(qū)域(600?800nm)熒光強度極弱，因此，優(yōu)選波長范圍為550_800nm的熒光染料以進一步提高靈敏度，更優(yōu)選熒光染料發(fā)射波長為665nm。
[0022]本發(fā)明的熒光染料包括有機熒光染料和稀土元素熒光染料。本發(fā)明的熒光染料可以偶聯(lián)到是膠乳微球上，變成了熒光微球的形式。本發(fā)明的熒光染料可以是單一化合物的熒光染料或者由幾種化合物組成的復合熒光染料，但優(yōu)選單一化合物熒光染料、且優(yōu)選具有較強的光穩(wěn)定性的熒光染料。本發(fā)明的熒光染料例如Alexa Fluro系列的熒光素。
[0023]本發(fā)明的人附睪分泌蛋白-4特異性抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。質控分子例如兔IgG，與質控分子特異性結合的生物分子例如羊抗兔IgG。
[0024]為了降低對熒光染料熒光信號的影響，本發(fā)明采用弱熒光的層析膜、底板以及扣卡，其熒光噪聲在大于550nm是會很弱，從而保證獲得高熒光信背比，能良好區(qū)分信號與背景，進而提高檢測靈敏度。優(yōu)選底板為白色，表面附有不干膠，且扣卡、層析膜、底板及不干膠均不含有熒光劑。
[0025]本發(fā)明中，待測樣品可以是血清或血漿，此時熒光免疫層析試紙條不包括血液分離膜。待測樣品也可以是全血，此時熒光免疫層析試紙條還包括血液分離膜，用于凝固、過濾細胞。血液分離膜可設置在標記墊和層析膜之間，分別與標記墊和層析膜直接毛細作用接觸，或者設置在樣品墊和標記墊之間，分別與樣品墊和標記墊直接毛細作用接觸，也可直接與樣品墊合并為同一結構，從而樣品墊同時具有樣品收集、釋放及過濾的作用。
[0026]本發(fā)明的熒光免疫層析試劑盒對待測樣品中的人附睪分泌蛋白-4進行定量檢測。檢測時，將待測樣品通過加樣孔加入到樣品墊中，樣品沿層析膜向吸水墊方向層析運動。樣品層析時間通常為8?25分鐘，優(yōu)選15分鐘。層析過后，用Wash緩沖液清洗層析膜，時間為3-8分鐘，優(yōu)選5分鐘，以降低本底，提高檢測靈敏度。本發(fā)明的Wash緩沖液中包含牛血清白蛋白、蔗糖和表面活性劑，pH值為7.0-8.0，其中，牛血清白蛋白的濃度為0.05?2%，蔗糖的濃度為I?15%，表面活性劑的濃度為0.05?2%。表面活性劑優(yōu)選吐溫20、曲拉通X-100，緩沖液優(yōu)選Tris-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液。
[0027]本發(fā)明的檢測用熒光定量儀包含激發(fā)光源模塊、濾光模塊、光電轉換模塊、控制分析模塊以及軟件系統(tǒng)。其中激發(fā)光源模塊包含光源及聚光裝置，該光源為發(fā)光二極管或激光二極管，且波長位于600?700nm之間。濾光模塊包含濾光片輪，該濾光片輪包含不同種濾光片，以獲取相應的熒光信號。光電轉換模塊包括圖像傳感器或者光電倍增管。
[0028]層析結束后，在光源激發(fā)下，試紙條產(chǎn)生的熒光信號經(jīng)濾光模塊濾除雜散光及背景熒光，到達光電轉換模塊，獲得數(shù)字信號，質控線獲得的熒光信號強度與檢測線獲得的熒光信號強度具有相關性:如果質控線熒光信號強度超出熒光定量儀內部設定的可接受值，說明檢測結果無效；在檢測結果有效前提下，檢測線獲得的熒光信號強度與質控線熒光信號強度的比值越高，表示樣品中目標檢測物的濃度越高，反之越低。
[0029]本發(fā)明采用熒光定量儀檢測一系列不同濃度的標準品，繪制標準曲線。其中標準曲線為標準品系列濃度(X)與所對應的熒光信號強度(Y)的關系曲線，關系式為Y =yO+bX，熒光信號強度為Y =檢測線峰面積/質控線峰面積，然后檢測樣品，依據(jù)標準曲線獲得待測樣品中人附睪分泌蛋白-4的濃度。
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