基于核酸適體熒光探針HCy4的同型半胱氨酸試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及基于核酸適體熒光探針的同型半 胱氨酸HCy試劑盒及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 同型半胱氨酸為一種含硫氨基酸，是生物體內(nèi)蛋氨酸代謝的中間產(chǎn)物，與半胱氨 酸相比，側(cè)鏈中多一個(gè)亞甲基。同型半胱氨酸是多種疾病的危險(xiǎn)因子，目前認(rèn)為同型半胱 氨酸增高是動(dòng)脈粥樣硬化所致心腦血管疾病最廣泛、最強(qiáng)獨(dú)立的致病因素。同型半胱氨酸 還與神經(jīng)管畸形、帕金森病、老年性癡呆、慢性腎功能衰竭等多種疾病及某些藥物、腫瘤的 影響有關(guān)。檢測(cè)同型半胱氨酸的方法主要色譜法、免疫學(xué)方法和循環(huán)酶法。
[0003] 色譜法：氣相色譜一質(zhì)譜法測(cè)定同型半胱氨酸。該法可同時(shí)測(cè)定半胱氨酸、蛋氨 酸、胱硫醚和甲基甘氨酸等多種物質(zhì)。色譜法靈敏度高、特異性好，但樣品處理、分離條件、 色譜柱制備諸多變異，使其難以標(biāo)準(zhǔn)化。而且HPLC設(shè)備價(jià)格昂貴、技術(shù)條件要求高，需專門 的維護(hù)人員，使其推廣困難。
[0004] 免疫學(xué)法：該法應(yīng)用特異性的抗S-腺苷同型半胱氨酸單克隆技術(shù)，采用熒光偏振 法或免疫法測(cè)定。同型半胱氨酸在S腺苷同型半胱氨酸水解酶和過量腺苷存在下，被轉(zhuǎn)換 成S腺苷同型半胱氨酸；預(yù)稀釋的混合物、抗-S-腺苷同型半胱氨酸單克隆抗體及標(biāo)記的熒 光S腺苷同型半胱氨酸示蹤物一同孵育，儀器自動(dòng)檢測(cè)偏振光的改變，即可測(cè)出標(biāo)本總同 型半胱氨酸水平?？贵w熒光分析法和比濁法不能直接檢測(cè)同型半胱胺酸，需一小時(shí)以上才 能出結(jié)果，操作步驟繁瑣。
[0005] 循環(huán)酶法；是利用酶底物特性，放大靶物質(zhì)（被測(cè)物）的檢測(cè)方法。血漿氧化型同 型半胱氨酸經(jīng)三乙羧乙基膦（TCEP)還原成游離型同型半胱氨酸，基于同型半胱氨酸甲基 轉(zhuǎn)移酶，S腺苷同型半胱氨酸水解酶構(gòu)成的循環(huán)酶體系以及脫氫酶輔酶體系的原理，分解產(chǎn) 物顯色，用自動(dòng)生化分析儀在600nm波長(zhǎng)測(cè)OD值得出血漿中的同型半胱氨酸的含量。
[0006] 目前沒有能夠直接識(shí)別同型半胱氨酸的抗體和其它分子探針。因此設(shè)計(jì)一種高度 設(shè)別同型半胱氨酸的分子探針，并基于此建立簡(jiǎn)單快速和廉價(jià)的檢測(cè)方法將提高對(duì)心腦血 管等于同型半胱氨酸相關(guān)的疾病的的監(jiān)控。
[0007] 核酸適配體是近年發(fā)展起來的一類新型識(shí)別分，是指能夠高特異性和高親和 力地域靶分子結(jié)的單鏈核苷酸分子。核酸適體可以通過配體指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù) (Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment，SELEX)篩選獲得。SELEX 技術(shù)是指應(yīng)用化學(xué)法合成大容量的隨機(jī)寡核苷酸（由兩端的固定序列和中間的隨機(jī)序列 組成）文庫(kù)，通過施加選擇壓力（結(jié)合靶目標(biāo)，淘選與靶目標(biāo)高度特異結(jié)合片段的過程）， 并結(jié)合體外擴(kuò)增技術(shù)，經(jīng)過多輪的循環(huán)選擇富集，獲得與靶物質(zhì)高度特異結(jié)合的寡核苷酸 分子，可以是RNA也可以是DNA，長(zhǎng)度一般為25~60個(gè)核苷酸。核酸適體主要通過發(fā)生 適應(yīng)性折疊，通過氫鍵、疏水堆積作用、范德華力與靶分子相互作用，與插入或包被的靶分 子形成穩(wěn)定的三維空間結(jié)構(gòu)。核酸適體不與靶分子結(jié)合時(shí)，核酸適體處于比較松散的結(jié)構(gòu)， 5'和3'兩端相互游離。與祀分子結(jié)合時(shí)，祀分子誘導(dǎo)核酸適體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，核酸適體的 5'端和3'端都將參與與靶分子特定區(qū)域（類似于與抗體結(jié)合的抗原位點(diǎn)）的相互作用，導(dǎo) 致5'和3'兩端相互靠近。這一特點(diǎn)使核酸適體適于分子信標(biāo)探針設(shè)計(jì)。其中一種分子信 標(biāo)設(shè)計(jì)利用了熒光染料芘分子。當(dāng)一個(gè)激發(fā)態(tài)芘分子和另一個(gè)基態(tài)芘分子近距離遭遇的時(shí) 候能形成激發(fā)態(tài)二聚體，能在比芘單體波長(zhǎng)更長(zhǎng)的位置釋放一個(gè)光子。芘激發(fā)態(tài)二聚體發(fā) 射峰在480到500nm，而芘單體的發(fā)射峰在370到400nm之間。另外，芘分子熒光壽命比生 物樣品中的非特異激發(fā)熒光的壽命長(zhǎng)，檢測(cè)時(shí)可以在非特異激發(fā)熒光消失后，再來收集激 發(fā)態(tài)二聚體的熒光信號(hào)，大大提高檢測(cè)的特異性和靈敏度。識(shí)別同型半胱氨酸的核酸適體 可以應(yīng)用于同型半胱氨酸的臨床檢測(cè)，提高檢測(cè)效率，降低檢測(cè)成本。
[0008] 核酸適體與靶物質(zhì)結(jié)合所呈現(xiàn)的高敏感性和高特異性，使其在疾病診斷中具有 良好的應(yīng)用前景，盡管目前成熟的臨床應(yīng)用報(bào)道較少，但應(yīng)用適體檢測(cè)靶蛋白的研宄卻不 斷增多，基于適體的檢測(cè)新技術(shù)也不斷出現(xiàn)。核酸適體由于其獨(dú)特的化學(xué)抗體特性成為新 一代針對(duì)特定蛋白的分子藥物或靶向載體，以及用于檢測(cè)其特異性識(shí)別的靶分子物質(zhì)。但 是目前基于核酸適體的針對(duì)于同型半胱氨酸HCy診斷試劑還很缺乏，且針對(duì)于同型半胱氨 酸HC y的核酸適體熒光探針檢測(cè)試劑盒的開發(fā)尚未見有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有的易產(chǎn)生操作技術(shù)誤差、重復(fù)性欠佳、干擾因素很多、操 作繁瑣、測(cè)試成本高等不足，提供一種基于核酸適體熒光探針的同型半胱氨酸HC yK劑盒及 其檢測(cè)方法。
[0010] 本發(fā)明的方案是通過這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0011] 一種基于核酸適體熒光探針的同型半胱氨酸試劑盒，其特征在于，主要成分包括： 含順4(：1、1'1^40了4-似 2的紅細(xì)胞裂解液；含1%(：12的0.21磷酸緩沖液；同型半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn) 品；同型半胱氨酸核酸適體熒光探針；所述同型半胱氨酸核酸適體熒光探針為5'和3'兩 端分別標(biāo)記焚光花分子單體的核苷酸單鏈，該核苷酸單鏈序列為：ggggctaatg ggtaccgtaa ccgttaagtt tggaatccct gttccaaccc。該序列命名為 HCy4〇
[0012] 以上所述的一種基于核酸適體熒光探針的同型半胱氨酸試劑盒，所述含NH4C1、 Tris、EDTA-NaJ^紅細(xì)胞裂解液為含有 1 ~280mmol/L NH4Cl, 1 ~34mmol/L Tris, 1 ~ 2mmol/LEDTA-Na2, pH 7. 0 ~7. 2 ;所述含]\%(：12的 0. 2M 磷酸緩沖液為含有 1 ~10mmol/L MgCl2O
[0013] 以上任一所述的一種基于核酸適體熒光探針的同型半胱氨酸試劑盒，其特征在 于，所述含NH 4C1、Tris、EDTA-Nad^紅細(xì)胞裂解液、含MgCl 2的0. 2M磷酸緩沖液、同型半胱 氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、同型半胱氨酸核酸適體熒光探針為配制好直接使用的液體試劑或是使用前需 加水溶解的干粉狀態(tài)。
[0014] 以上所述的一種基于核酸適體熒光探針的同型半胱氨酸試劑盒，其特征在于，該 試劑盒用于檢測(cè)肝素抗凝全血或末梢血中的同型半胱氨酸濃度。
[0015] -種用以上任一所述基于核酸適體熒光探針的同型半胱氨酸試劑盒來檢測(cè)同型 半胱氨酸濃度的方法，其特征在于，方法步驟包括：
[0016] (1)血樣裂解：將血樣和含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的紅細(xì)胞裂解液按1:0. 5~5體 積比混勾，靜置5~30min，再中速離心5~lOmin，收集上清液；
[0017] ⑵混合卵育：混合卵育：取20~100 μ 1步驟1)得到的上清液和30~50ul的 用含MgCld^ 0. 2M磷酸緩沖液，溶解同型半胱氨酸核酸適體熒光探針得到的同型半胱氨酸 核酸適體熒光探針試劑混合，室溫下卵育5~15min，使同型半胱氨酸核酸適體熒光探針與 血樣充分結(jié)合，得到測(cè)試液；
[0018] (3)熒光檢測(cè)：熒光檢測(cè)儀檢測(cè)步驟2)得到的測(cè)試液50ul，在熒光檢測(cè)儀熒光激 發(fā)后，讀取熒光激發(fā)后20至IOOns時(shí)間段內(nèi)波長(zhǎng)在480~500nm的熒光值；
[0019] (4)結(jié)果計(jì)算：使用生物醫(yī)學(xué)作圖軟件，參照同型半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品制作的標(biāo)準(zhǔn) 曲線，結(jié)合步驟3)中檢測(cè)到的熒光值計(jì)算出血樣中同型半胱氨酸的濃度。
[0020] 以上所述的生物醫(yī)學(xué)軟件為Sigma plot軟件，于市面上可以購(gòu)買到。
[0021] 以上所述的一種用基于核酸適體熒光探針的同型半胱氨酸試劑盒來檢測(cè)同型半 胱氨酸濃度的方法，其特征在于，所述同型半胱氨酸核酸適體熒光探針試劑中同型半胱氨 酸核酸適體熒光探針濃度為200~400nmol/L，其特性還在于，所述同型半胱氨酸核酸適 體熒光探針為5'和3'兩端分別標(biāo)記熒光芘分子單體的核苷酸單鏈，該核苷酸單鏈序列為： ggggctaatg ggtaccgtaa ccgttaagtt tggaatccct gttccaaccc〇
[0022] 同型半胱氨酸核酸適體熒光探針不與同型半胱氨酸結(jié)合時(shí)，核酸適體處于比較松 散的結(jié)構(gòu)，5'和3'兩端的花分子