急性缺血性腦卒中多種蛋白標志物聯(lián)合診斷模型的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及急性缺血性腦卒中領(lǐng)域，為一種全新的多種蛋白診斷模型，對急性缺血性腦卒中進行早期的篩查和早期檢測，其敏感性和特異性均達到90%以上。
【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)WHO的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，全球每6秒，腦卒中奪去一個生命；每隔一秒，腦卒中襲擊一個人；每年1500萬人腦卒中,600萬人死于腦卒中，3000萬人因腦卒中而殘疾。目前中國是老齡化最快的國家之一，因此腦卒中造成的死亡率仍在不斷攀升。50-65%的腦卒中病例是由缺血性事件所引起。腦卒中病程進展快，帶來的后果又十分嚴重，因此該疾病的早診斷早治療對于預(yù)后有著重大的影響。目前，由于尚無快速簡便的實驗室血液檢測方法用于該疾病的篩查和早期檢測，耽誤了最佳治療時機或延誤治療，給神經(jīng)系統(tǒng)帶來不可恢復(fù)的損傷，甚至有8%的患者會發(fā)生再次卒中。
[0003]定量蛋白質(zhì)組學(xué)，近年來獲得了巨大的技術(shù)進步，主要體現(xiàn)在各類高分辨率質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用。以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)，主要可以分成兩類，第一是穩(wěn)定同位素標記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)，比如SILAC和iTRAQ ;另一類是非標記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，比如使用Maxquant軟件進行的非標記蛋白質(zhì)組學(xué)分析。
[0004]本團隊采用非標記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對部分急性缺血腦卒中和正常人群血清蛋白就行分析，特異蛋白經(jīng)過Western Blot技術(shù)驗證,最后經(jīng)過ELLISA技術(shù)在剩余人群中分析尋找出有臨床診斷意義的蛋白。
[0005]本發(fā)明目的在于提供一種用于急性缺血性腦卒中診斷的多種特征蛋白模型。
[0006]主要發(fā)現(xiàn)
[0007](I)本團隊過去三年，在國家自然科學(xué)基金和財政部專項資金的支持下，建立了質(zhì)譜技術(shù)篩查急性缺血性腦卒中血清蛋白標志物的篩查和驗證工作。在前期工作過程中，與正常對照人群相比較，急性缺血性腦卒中患者血清中29種蛋白有統(tǒng)計學(xué)差異(P < 0.05):其中19 f中蛋白的錯誤發(fā)現(xiàn),率(false discovery rate)小于0.05其中，Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate5-phosphatase I (SHIPl), Isoform I ofInsulin-like growth factor I (IGFl), Serum deprivat1n-response protein(SDRP),Mannose-binding protein (MBL), Intercellular adhes1n molecule I (CAMl),C—reactive protein (CRP), LPA Apolipoprotein(a), Macrophage mannose receptorI (MRCl) 8種蛋白在剩余患者和對照人群中經(jīng)過ELISA方法驗證，血清含量表達具有明顯差異(P < 0.05).
[0008](2)其中，SHIPl，SDRP, CAMl，MRCl四種特異蛋白與急性缺血性腦卒中發(fā)病之間的關(guān)聯(lián)性為本團隊首次發(fā)現(xiàn)。
[0009](3)8種蛋白聯(lián)合診斷急性缺血性腦卒中的蛋白芯片試劑盒開發(fā)。
[0010]本發(fā)明檢測急性缺血性腦卒中特征蛋白，可用于建立血清特征蛋白質(zhì)模型以及應(yīng)用于在急性缺血性腦卒中篩查和早期檢測。
[0011]本發(fā)明與其它急性缺血性腦卒中的檢測方法比較，具有以下優(yōu)點:
[0012]第一，與以往的血清學(xué)檢測方法比較具有較高的敏感性和特異性，并能用于急性缺血性腦卒中篩查和早期檢測中。
[0013]第二，本發(fā)明模型的構(gòu)建方法設(shè)計合理可行，為提供急性缺血性腦卒中新的篩查和早期診斷方法，同時也為探索急性缺血性腦卒中早期預(yù)防提供了新的思路。
[0014]第四，利用本發(fā)明分析了 220份血清樣品，其中對照組120，驗證結(jié)果顯示兩組間有明顯差異，因此本發(fā)明可對急性缺血性腦卒中進行早期篩查和診斷，降低死亡率和致殘率，提高患者的生活質(zhì)量，減少經(jīng)濟負擔(dān)。
[0015]后期驗證
[0016](I)在小樣本的前期分析過程中(162例AIS，120例正常對照)，我們發(fā)現(xiàn):AIS血清SHIP-1濃度明顯高于對照人群(圖1)。血清SHIP-1含量與卒中的嚴重程度，梗死面積成明顯正相關(guān)(圖1)。此外根據(jù)受試者工作特征曲線(ROC curve)，用于診斷腦卒中的血清中SHIPl含量的最佳臨界值為1550pg/ml，由此得到77.5%的靈敏度及88.3%的特異度(圖1)。多變量分析結(jié)果表明在考慮了其他混合因素之后，SHIP-1水平高于1550pg/ml (OR
4.28,95% Cl:1.97-8.96)的患者 AIS 的風(fēng)險升高。
[0017](2)同期研究發(fā)現(xiàn)，AIS血清MBL濃度明顯高于對照人群(圖2)，(1332 ；IQR,996-2134ug/L and 897 ;IQR，678-1100ug/L，respectively).。血清 MBL 含量與卒中的嚴重程度成明顯正相關(guān)(圖2), (r [spearman] = 0.608,p < 0.0001)。多元分析結(jié)果表明在排除其它影響因素之后血清MBL含量與AIS風(fēng)險相關(guān)(OR 1.002,95% Cl:1.001-1.008 ；p =0.000)。根據(jù)ROC曲線圖預(yù)測用于診斷AIS的血清中MBL含量的最佳臨界值為1033pg/ml，以此得到81.0 %靈敏度和78%的特異度。曲線下面積為0.763(95% Cl, 0.704-0.821，圖2)。與 Hs-CRP (AUC0.57 (0.50-0.65)，P = 0.036)及 HCY (AUC 0.69 (0.62-0.77)，p = 0.01)相比MBL診斷的準確度更高。
[0018](3)卒中患者血清Lp(a)水平明顯高于對照人群(328[IQR，173-554]vsl45[IQR，66-254]mg/L, respectively ；P = 0.000),圖3.血清Lp (a)含量與卒中的嚴重程度,梗死面積成明顯正相關(guān)(P = 0.000,圖3).在整組中，排除其他可能的風(fēng)險因素后，Lp (a)水平是一個獨立的影響卒中風(fēng)險的因素，血清Lp (a)含量大于300mg/L時相應(yīng)AIS風(fēng)險提高了2.23倍(P = 0.015)。另外上述關(guān)系在男性患者中表現(xiàn)更為明顯。
【附圖說明】
[0019]圖1SHIP-1診斷急性缺血性腦卒中價值分析。
[0020]圖2MBL診斷急性缺血性腦卒中價值分析。
[0021]圖3Lpa診斷急性缺血性腦卒中價值分析。
[0022]目前，對于急性缺血性腦卒中的診斷，主要依賴于患者的臨床表現(xiàn)和神經(jīng)影像學(xué)資料，如CT或MRI。對于出血性腦卒中的診斷，CT檢查是行之有效的方法，而對于缺血性腦卒中尤其是程度較輕的病例，CT的作用大不如前者；雖然腦部的MRI檢查對于該疾病的診斷作用顯而易見，但由于其價格昂貴、耗費時間長，且很多急診醫(yī)療部門無能力配置如此龐大的設(shè)備，同時可能由于患者自身原因，如躁動不安，有心臟起搏器或其他金屬植入物而無法進行檢查，以上種種原因限制了 MRI的廣泛使用。本發(fā)明獲得的生物學(xué)診斷模型為其早期診斷并及時選擇適當?shù)闹委煼桨柑峁┛焖贉蚀_的生物標記物，這對于急性缺血性腦卒中患者的治療和預(yù)后將具有非常重大的意義，在很大程度上可以提高患者病后的生活質(zhì)量，減輕家庭和社會的負擔(dān)，節(jié)約醫(yī)療資源。如該發(fā)明能實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，應(yīng)用于高危人群的院外甚至家庭診斷，必將對急性缺血性腦卒中的預(yù)防和早期治療產(chǎn)生深遠影響。
【主權(quán)項】
1.本團隊過去三年，在國家自然科學(xué)基金和財政部專項資金的支持下，建立了質(zhì)譜技術(shù)篩查急性缺血性腦卒中血清蛋白標志物的篩查和驗證工作。在前期工作過程中，與正常對照人群相比較，急性缺血性腦卒中患者血清中29種蛋白有統(tǒng)計學(xué)差異(P< 0.05);其中19種蛋白的錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate)小于0.05。其中，Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate 5-phosphatasel(SHIPl), Isoform I ofInsulin-like growth factor I (IGFl), Serum deprivat1n-response protein (SDRP),Mannose-binding protein (MBL), Intercellular adhes1n molecule I (CAMl),C-reactive protein (CRP), LPA Apolipoprotein (a), Macrophage mannose receptorI (MRCl)8種蛋白在剩余患者和對照人群中經(jīng)過ELISA方法驗證，血清含量表達具有明顯差異(P <0.05).其中SHIPl，SDRP，CAMl，MRCl為首次發(fā)現(xiàn)的與卒中發(fā)生有關(guān)的特意蛋白。
2.建立權(quán)利要求1所述的蛋白，包括如下內(nèi)容: 1)SHIPl，SDRP, CAMl，MRCl四種特異蛋白與急性缺血性腦卒中發(fā)病之間的關(guān)聯(lián)性為本團隊首次發(fā)現(xiàn)。 2)8種蛋白聯(lián)合診斷急性缺血性腦卒中的蛋白芯片試劑盒。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種急性缺血性腦卒中多種蛋白標志物聯(lián)合診斷模型。本團隊在國家自然基金支持下，運用質(zhì)譜技術(shù)篩查急性缺血性腦卒中(AIS)血清蛋白標志物。與正常人群相比，AIS患者血清中19種蛋白的錯誤發(fā)現(xiàn)率小于0.05。其中，SHIP1 IGF1，SDRP，MBL，CAM1，CRP，LPa，MRC1 8種蛋白在剩余AIS患者和對照人群中經(jīng)過Western Blot技術(shù)和EL ISA方法驗證，血清含量表達具有明顯差異(p<0.05)。其中SHIP1，SDRP，CAM1，MRC1為首次發(fā)現(xiàn)的與AIS發(fā)生有關(guān)的特意蛋白。本申請意在保護我們發(fā)現(xiàn)的8種蛋白質(zhì)輔助診斷AIS的診斷模型。該模型對于AI S患者的早期診斷具有重要意義。
【IPC分類】G01N33-68, G01N27-62
【公開號】CN104677974
【申請?zhí)枴緾N201310624645
【發(fā)明人】陳惠 , 劉小野, 涂文軍, 王屹, 于燕
【申請人】陳惠 , 劉小野, 涂文軍
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2013年12月2日