一種固定化的抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種固定化的抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鹽酸克倫特羅（CL)俗名"瘦肉精"，可顯著提高胴體的瘦肉率，因而被濫用于飼養(yǎng) 業(yè)，并通過食物鏈在人體內(nèi)富集，對人體造成多種毒副作用，甚至死亡。基于抗原抗體特異 識別的免疫檢測技術(shù)因其具有高度特異性、敏感性和穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，已成為較常用的CL殘 留的檢測方法。但這種方法存在檢測時(shí)間長、需要專業(yè)人員操作等缺點(diǎn)，不能用于現(xiàn)場和快 速檢測。
[0003] 免疫傳感器是一種將固定化抗體與換能器密切配合，對特定目標(biāo)分析物具有選擇 性和響應(yīng)的分析裝置。該裝置既具有免疫檢測技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，又具有傳感器操作簡單、方便、 快捷的特點(diǎn)，已成為CL快速檢測領(lǐng)域的研究開發(fā)熱點(diǎn)。
[0004] 在免疫傳感器制備過程中，固定化抗體的穩(wěn)定性和活性是保證該法測定CL靈敏 度與特異性的關(guān)鍵因素。目前對抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體（以下簡稱CL mAb)的固定方 式主要為物理吸附或化學(xué)交聯(lián)法，采用物理吸附方式制備的固定化抗體在使用過程中存在 不穩(wěn)定、容易脫落和滲漏等技術(shù)問題，而通過化學(xué)交聯(lián)方式制備的固定化抗體雖穩(wěn)定，但存 在活性損失嚴(yán)重等技術(shù)問題。為了保證固定化抗體的生物活性，固定前一般需采用色譜聯(lián) 用技術(shù)對含抗體的小鼠腹水進(jìn)行分離純化，整個(gè)分離過程繁瑣耗時(shí)，難以實(shí)現(xiàn)快速、高通量 分離目。這些都嚴(yán)重限制了以固定化抗體為敏感元件的免疫傳感器在CL檢測中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是為了解決固定化抗體在免疫傳感器的應(yīng)用中存在不穩(wěn)定、容易脫 落、滲漏或活性較低的技術(shù)問題，而提供一種固定化抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的制備方 法。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)原理 雙水相萃取技術(shù)是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的選擇性分配對進(jìn)入體系的物質(zhì)進(jìn)行分離。具有 分離時(shí)間短(一般只需30-60min)、選擇性好、易于實(shí)現(xiàn)放大和進(jìn)行連續(xù)性操作等優(yōu)點(diǎn)。但經(jīng) 雙水相系統(tǒng)提純富集后，對分散于PEG相中抗體的進(jìn)一步分離及PEG的回收是目前存在的 技術(shù)難點(diǎn)。采用原位固定的方式將分散于PEG相中的抗體直接固定于載體上，可同時(shí)實(shí)現(xiàn) 抗體的固定和PEG相的回收再利用，同時(shí)由PEG形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可防止固定化抗體的滲漏， 增加了固定化抗體的穩(wěn)定性和活性。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案 一種固定化的抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體（CL mAb)的制備方法，具體包括如下步驟： (1)、含CL mAb腹水的制備，即通過細(xì)胞融合技術(shù)及間接酶聯(lián)免疫法篩選出穩(wěn)定分泌 抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；然后進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，每隔24h傳代一次，使其 處于對數(shù)生長期；然后將處于對數(shù)生長期的穩(wěn)定分泌抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的雜交瘤 細(xì)胞注射于用石蠟初步免疫過的小鼠腹部，兩周后采集腹水，即得到含有抗鹽酸克倫特羅 單克隆抗體的腹水，步驟如下； ① 、將25mg鹽酸克倫特羅（以下簡稱CL)溶解于IOmL的濃度為lmol/L的鹽酸水溶液 中，向其中緩慢滴加〇. 27mol/L的亞硝酸鈉溶液，直至淀粉KI試紙顏色變?yōu)樯钭仙笸Ｖ?滴加，并繼續(xù)反應(yīng)45min，再加入0.1 mL質(zhì)量百分比濃度為5%的氨基磺酸銨水溶液終止反 應(yīng)，即得重氮化的CL ; 將上述所得的重氮化的CL加入到5mL濃度為lOOmg/mL的牛血清白蛋白（以下簡稱 BSA)水溶液中，4°C下緩慢攪拌反應(yīng)24h，反應(yīng)過程中以lmol/L的NaOH溶液維持pH為 9. 0-9. 5,反應(yīng)完畢后，對反應(yīng)液進(jìn)行透析，得到CL-BSA偶聯(lián)物； ② 、對6-8周齡、體重18-22g的雌性純系Balb/C小鼠進(jìn)行腹腔注射免疫； 初次免疫采用充分乳化的等體積的CL-BSA偶聯(lián)物與福氏完全佐劑，劑量為50 μ g/ 只； 2周后加強(qiáng)免疫，每隔兩周一次，加強(qiáng)免疫以福氏不完全佐劑代替福氏完全佐劑，劑量 為 100 μ g/ 只； 從第三次加強(qiáng)免疫開始，每次加強(qiáng)免疫后第三天進(jìn)行眼眶采血，通過間接酶聯(lián)免疫法 (以下簡稱IELISA)測定其血清中抗體活性，直至血清0D450nm大于I. 0時(shí)停止免疫； ③ 、停止加強(qiáng)免疫后，取出小鼠脾臟破碎成單個(gè)的細(xì)胞懸液，并與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按 照3-10 :1的比例混勻，得到混懸液； 向所得的混懸液中加入1ml質(zhì)量百分比濃度為50%的PEG4000水溶液，緩慢搖勻融合 Imin后，得到融合細(xì)胞，將所得的融合細(xì)胞放入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入100 μ L/孔的HAT 培養(yǎng)基，并控制溫度為37°C，0)2和空氣按體積比計(jì)算，CO2:空氣為5:100的環(huán)境下培養(yǎng)兩 周，得到融合細(xì)胞； 向上述所得的融合細(xì)胞中加入100 μ L/孔的HT培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)24h，所得的細(xì)胞培養(yǎng) 液離心，所得的上清液進(jìn)行IELISA檢測，最終篩選到能穩(wěn)定分泌抗鹽酸克倫特羅單克隆抗 體的高特異性的雜交瘤細(xì)胞株，其效價(jià)大于3 X IO6; ?、取6-8周的Balb/C小鼠，按照ImL/只的量，向Balb/C小鼠腹腔注射液體石錯(cuò)，七 天后腹腔接種上述處于對數(shù)生長期的能穩(wěn)定分泌抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的雜交瘤細(xì) 胞，每只注射IX IO6個(gè)對數(shù)生長期的能穩(wěn)定分泌抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的雜交瘤細(xì) 胞，兩周后采集腹水，即得到含有抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的腹水，記為含有CL mAb的腹 水； (2 )、含有抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的腹水的純化 ① 、配制PEG6000/磷酸鹽雙水相體系，所述的PEG6000/磷酸鹽雙水相體系，按重量 百分比計(jì)算，含15%的分子量為6000的PEG，15%的磷酸氫二鉀（K 2HPO4) /磷酸二氫鈉 (NaH2PO4)溶液（ρΗ8· 0)、15%的NaCl和余量的去離子水構(gòu)成； ② 、將步驟（1)所得的含有CL mAb的腹水置于PEG6000/磷酸鹽雙水相體系中，混合均 勻后，于4°C靜置60min; ③ 、將②中靜置60min后的體系4000r/min離心10min，收集上相即得到純化后的含有 CL mAb 的 PEG 相； (3) 、聚苯乙烯小球的預(yù)處理 ① 、將直徑為3mm的聚苯乙烯小球浸入質(zhì)量百分比濃度為0. 01%的新潔爾滅水溶液中， 4 °C攪拌過夜； ② 、依次采用去離子水和0. 〇lmol/L、pH7. 2的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀緩沖液清洗聚 苯乙烯小球，然后在控制溫度為35°C的烘箱中烘干，即得預(yù)處理后的聚苯乙烯小球； (4) 、抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的原位固定 ① 、按聚苯乙烯小球：純化后的含有CL mAb的PEG相為1粒聚苯乙烯小球：0. 65 mL純 化后的含有CL mAb的PEG相的比例，將步驟（3)中預(yù)處理后的聚苯乙烯小球完全浸沒于步 驟（2)中所得的純化后的含有CL mAb的PEG相中，4°C條件下緩慢攪拌吸附90min，即得固 定化抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的微球，記為固定化CL mAb的微球； ② 、用雙蒸水對①中獲得的固定化CL mAb的微球進(jìn)行清洗，直到清洗液中檢不出CL mAb活力為止； ③ 、將②中清洗后的固定化CL mAb的微球控制在4°C的條件進(jìn)行脫水，脫水完成后，即 完成了 CL mAb的固定化，得到固定化抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體，即為固定化的CL mAb。
[0008] 上述所得的固定化的CL mAb置于0. 02M、pH9. 6的碳酸鈉和碳酸氫鈉緩沖液中，控 制溫度為4°C貯存?zhèn)溆谩?br>[0009] 將上述所得的固定化的CL mAb充滿到干凈的兩端帶篩網(wǎng)的柱式殼體中，即得固定 化CL mAb的小柱，在4°C貯藏30天后，固定化CL mAb的小柱仍保留初始活性的95%，用恒 流泵以lml/min的流速連續(xù)沖刷30ml的0.0 lmol/L、pH7. 2的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀緩 沖液后，固定化CL mAb的小柱仍保留初始活性的98%。
[0010] 本發(fā)明的有益效果 本發(fā)明的一種固定化的抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的制備方法，由于采用操作條件溫 和的PEG6000/磷酸鹽雙水相體系純化和原位固定結(jié)合的方法，因此不僅能夠更高效的對 小鼠腹水中的CL mAb進(jìn)行分離純化，CL mAb的回收率達(dá)85%以上。還能獲得活力較高的 固定化的CL mAb，其0D450nm為1. 8。同時(shí)也實(shí)現(xiàn)了 PEG相的再利用。
[0011] 本發(fā)明提供的一種固定化的抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的制備方法，由于形成 PEG6000/磷酸鹽雙水相體系的相組分價(jià)格較低，且PEG6000/磷酸鹽雙水相體系純化和原 位固定方法操作簡便，因此其制備成本低廉，可適用于規(guī)?；a(chǎn)。
[0012] 進(jìn)一步，本發(fā)明提供的一種固定化的抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的制備方法，由 于直接在含有CL mAb的PEG相中進(jìn)行原位固定，因此PEG形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)增加了固定化的 CL mAb的穩(wěn)定性。固定化的CL mAb柱在4°C|C藏30天后，固定化的CL mAb仍保留初始活 性的95%。用恒流泵以lmL/min的流速連續(xù)沖刷30mL后，固定化的CL mAb仍保留初始活性 的 98%。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明。
[0014] 本發(fā)明所用的HAT培養(yǎng)基、HT培養(yǎng)基、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG (免疫 球蛋白）、福氏完全佐劑及福氏不完全佐劑購自于生工生物工程(上海）股份有限公司； 本發(fā)明中的效價(jià)定義，即在96孔板內(nèi)使CL-BSA偶聯(lián)物與倍比稀釋的CL mAb發(fā)生特異 性結(jié)合，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，根據(jù)顯色反應(yīng)來鑒定抗體與抗原的結(jié) 合情況，并且以吸光度值大于陰性對照2. 1倍時(shí)的稀釋倍數(shù)作為CL mAb的效價(jià)。
[0015] 實(shí)施例1 一種抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體在雙水相體系中的原位固定方法，具體包括如下步 驟： (1)、含CL mAb腹水的制備 ① 、將25mg CL溶解于lmol/L的鹽酸溶液中，向其中緩慢滴加0· 27mol/L的亞硝酸鈉 溶液，直至淀粉KI試紙顏色變?yōu)樯钭仙笸Ｖ沟渭?，并繼續(xù)反應(yīng)45min，再加入5%氨基磺酸 銨終止反應(yīng)，得到重氮化的CL ; 將該重氮物滴入lOOmg/mL的BSA溶液中，4°C下緩慢攪拌反應(yīng)24h，反應(yīng)過程中以 lmol/L的NaOH溶液維持pH為9. 0-9. 5,反應(yīng)完畢后，對反應(yīng)液進(jìn)行透析即獲得CL-BSA偶 聯(lián)物； ② 、對6-8周齡、體重18-22g的雌性純系Balb/C小鼠進(jìn)行腹腔注射免疫，初次免疫采 用充分乳化的等體積的CL-BSA偶聯(lián)物與福氏完全佐劑，劑量為50 μ g/只； 2周后加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫時(shí)以福氏不完全佐劑代替福氏完全佐劑，劑量為100 μ g/ 只； 從第三次免疫開始，每次免疫后第三天進(jìn)行眼眶采血，通過IELISA法測定其血清中抗 體活性，直至血清〇D450nm大于I. 0時(shí)停止免疫； ③ 、停止免疫后，取出小鼠脾臟破碎成單個(gè)的細(xì)胞懸液，并與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按照 3-10 :1的比例混勻，向其中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的PEG4000溶液進(jìn)行緩慢搖勻融合。融 合Imin后，將融合細(xì)胞放入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入HAT培養(yǎng)基，并置于5%C0 2、37°C培養(yǎng) 箱培養(yǎng)兩周；兩周后再用HT培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并對細(xì)胞培養(yǎng)液的上清進(jìn)行IELISA檢測，最 終篩選到能穩(wěn)定分泌抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的高特異性的雜交瘤細(xì)胞株，其效價(jià)大于 3 X 106；