一種基于定量核磁共振氫譜法測定芳基萘內酯型木脂素純度的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥化工領域，特別是一種基于定量核磁共振氫譜法測定芳基萘內酯 型木脂素純度的方法。
【背景技術】
[0002] 由于生物合成的復雜性，天然產物的結構也復雜多樣。以常規(guī)的色譜學方法為主 的分離純化手段往往很難將結構非常相似的天然產物分離開來，而天然產物中混有痕量的 高活性的雜質會導致生物活性的錯誤結論。據(jù)相關報道，天然產物熊果酸具有120種生物 活性，有些生物活性在不同的文獻中是完全相反的，如抗菌活性，細胞毒活性。出現(xiàn)這樣結 論的原因是，測試活性所用的熊果酸樣品不是單一的熊果酸化學實體，與其共存的雜質嚴 重影響了活性結果。因此建立完善的天然產物純度評價方法是其準確的生物活性評價的必 要條件。同時高純度的天然產物也是相關藥材質量評價所必須的。因此天然產物的純度評 價是非常重要的。
[0003] 芳基萘內酯型木脂素是從植物中發(fā)現(xiàn)的數(shù)目較多的一類木脂素，目前已在40余 種植物中有報道。該類化合物具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌、殺蟲等作用。芳基萘內酯型木 脂素類化合物以鬼臼毒素為代表，其衍生物依托泊苷（etoposide，VP-16)和替尼泊苷 (teniposide，VM-26)于上個世紀80年代應用于臨床，對乳腺癌、睪丸癌、小細胞肺癌、淋 巴癌、兒童白血病等多種癌癥均有良好的治療效果，以鬼臼毒素為代表的芳基萘內酯型木 脂素是目前研宄最深入的一類天然產物之一，一直備受國內外學者的廣泛關注。此類化合 物在相關藥材中的含量主要通過薄層色譜，高效液相色譜，毛細管電泳色譜，其中以帶有紫 外檢測器的高效液相色譜方法最為普遍，這種方法對于那些沒有紫外吸收的化合物無法檢 測，必須有高純度標準品作對照，該標準品價格昂貴、不易獲得，且此操作方法復雜耗時長。 定量核磁共振氫譜法，由于其操作快速簡便、樣品消耗量少、同時給出定性的結構信息和定 量分析結果，特別是定量核磁共振氫譜法不依賴于被測物的高純度標準品，因此定量分析 的成本大大降低。利用定量核磁共振氫譜法，選擇內標物替代使用目標測試物的標準品做 外標的高效液相色譜法進行芳基萘內酯型木脂素的純度測定是一項非常重要的研宄工作。 但至今尚未見到采用定量核磁共振氫譜法測定芳基萘內酯型木脂素的純度的公開報道。

【發(fā)明內容】

[0004] 針對上述情況，為了克服現(xiàn)有技術之缺陷，本發(fā)明提供一種基于定量核磁共振氫 譜法測定芳基萘內酯型木脂素純度的方法，可有效解決現(xiàn)有芳基萘內酯型木脂素純度檢測 技術成本高、對照品不易獲得，操作方法復雜、耗時長的問題。
[0005] 本發(fā)明解決的技術方案為，該方法包括以下步驟：稱取10_14mg的內標物，溶解 于0. 8-1. 2mL的DMS0-d6中，制備成內標物溶液；稱取10-50mg的芳基萘內酯型木脂素， 溶解于〇.8-1. 2mL的DMS0-d6中，制備成目標分析物溶液；量取80-120yL的內標物溶 液，180-220 y L的目標分析物溶液，180-220 y L的DMS0-d6,轉移到離心管中，制成樣品溶 液，將該樣品溶液混懸25-35S，轉移至核磁管中，進行定量核磁測試，定量核磁測試的條 件：掃描次數(shù)（NS)，8或16 ;光譜寬度（SW)，15-25ppm ;弛豫時間（Dl)，16-35s ;測試溫度， 20-30°C;脈沖角度，30°，或45°，或90° ;采集時間（AQ)，2.5-3.5s;測定內標物上芳香質 子和芳基萘內酯型木脂素H-2, 6的峰面積，得出目標分析物相對于內標物的摩爾質量比， 再通過目標分析物與內標物的質量比依據(jù)公式：
[0006]
【主權項】
1. 一種基于定量核磁共振氫譜法測定芳基萘內酯型木脂素純度的方法，其特征在于， 該方法包括以下步驟：稱取l〇-14mg的內標物，溶解于0. 8-1. 2mL的DMS0-d6*，制備成內 標溶液；稱取10_50mg的芳基萘內酯型木脂素，溶解于0. 8-1. 2mL的DMSO-de*，制備成目 標分析物溶液；量取80-120 y L的內標溶液，180-220 y L的目標分析物溶液，180-220 y L的 DMS0-d6，轉移到離心管中，即得樣品溶液，將該樣品溶液混懸25-35S，轉移至核磁管中，進 行定量核磁測試，所述的定量核磁測試的條件：掃描次數(shù)，8或16 ;光譜寬度，15-25ppm ;弛 豫時間，16-35s;測試溫度，20-30°C;脈沖角度，30°，或45°，或35° ;采集時間，2. 5-3. 5s; 測定內標物上芳香質子和芳基萘內酯型木脂素H-2,6的峰面積，得出目標分析物相對于內 標物的塵爾質量"比，?誦討日標分析物與內標物的質量比依據(jù)公式：
計算出目標分析物的純度Px，其中： lx為目標分析物的峰面積；Istd為內標的峰面積；Nx為目標分析物的原子核的數(shù)目；Nstd為內標的原子核的數(shù)目；Mx為目標分析物的摩爾質量；Mstd為內標的摩爾質量;Mx為目 標分析物的質量;mstd為內標的質量；Px為目標分析物的純度；Pstd為內標物的純度； 所述的芳基萘內酯型木脂素為去氧鬼臼毒素，鬼臼毒素，4-去甲鬼臼毒素，鬼臼 毒素-7' -O-0-D-吡喃葡萄糖苷，4-去甲鬼臼毒素-7' -O-0-D-吡喃葡萄糖苷， sinolignanA中的任一種； 所述內標物為1，4-二硝基苯，3, 4, 5-三氯吡啶，1，3, 5-三氯-2-硝基苯中的任一種。
2. 根據(jù)權利要求1所述的一種基于定量核磁共振氫譜法測定芳基萘內酯型木脂素 純度的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：稱取12. 47mg的1，4-二硝基苯，溶解于 1.OmL的DMSO-d#，制備成1，4-二硝基苯內標溶液；稱取28. 61mg的去氧鬼白毒素，溶解 于1.OmL的DMSO-df^，制備成去氧鬼臼毒素目標分析物溶液；量取100yL的1，4-二硝基 苯內標溶液，200yL的去氧鬼臼毒素目標分析物溶液，200yL的DMS0-d6，轉移到離心管中， 即得樣品溶液，將該樣品溶液混懸30s，轉移至核磁管中，進行定量核磁測試，所述的定量核 磁測試的條件：掃描次數(shù)16 ;光譜寬度，20ppm;弛豫時間，16s;測試溫度，25°C;脈沖角度， 30° ;米集時間，3. 2s;測定1，4-二硝基苯上芳香質子和去氧鬼白毒素H-2,6的峰面積，得 出去氧鬼臼毒素相對于1，4-二硝基苯的摩爾質量比，再通過去氧鬼臼毒素與1，4-二硝基 苯的質量比依據(jù)公式計算出去氧鬼白毒素的純度。
3. 根據(jù)權利要求1所述的一種基于定量核磁共振氫譜法測定芳基萘內酯型木脂素 純度的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：稱取12. 85mg的1，4-二硝基苯，溶解于 l.OmL的DMSO-d#，制備成1，4_二硝基苯內標溶液；稱取29.95mg的鬼臼毒素，溶解于 1.OmL的DMSO-c^，制備成鬼臼毒素目標分析物溶液；量取100yL的1，4-二硝基苯內標 溶液，200yL的鬼臼毒素目標分析物溶液，200yL的DMS0-d6，轉移到離心管中，即得樣品溶 液；將該樣品溶液混懸30s，轉移至核磁管中，進行定量核磁測試，所述的定量核磁測試的 條件：掃描次數(shù)，16 ;光譜寬度，20ppm;弛豫時間，16s;測試溫度，25°C;脈沖角度，30° ;采 集時間，3.2s;測定1，4-二硝基苯上芳香質子和鬼臼毒素H-2,6的峰面積，得出鬼臼毒素相 對于1，4-二硝基苯的摩爾質量比，再通過鬼臼毒素與1，4-二硝基苯的質量比依據(jù)公式計 算出鬼臼毒素的純度。
4. 根據(jù)權利要求1所述的一種基于定量核磁共振氫譜法測定芳基萘內酯型木脂素 純度的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：稱取12. 90mg的1，4-二硝基苯，溶解于 1.OmL的DMSO-d#，制備成1，4-二硝基苯內標溶液；稱取29. 35mg的4-去甲鬼臼毒素，溶 解于1.OmL的DMSO-d#，制備成4-去甲鬼臼毒素目標分析物溶液；量取100yL的1，4-二 硝基苯內標溶液，200yL的4-去甲鬼臼毒素目標分析物溶液，20