檢測大腸桿菌的dna電化學(xué)生物傳感器及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分析化學(xué)和化學(xué)傳感器技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種檢測大腸桿菌16SrDNA(核糖體DNA)核酸的電化學(xué)生物傳感器及其制備方法，用于檢測大腸桿菌。
【背景技術(shù)】
[0002]大腸桿菌是嚴(yán)重危害健康的食源性腸道致病菌之一，實(shí)現(xiàn)對大腸桿菌的快速檢測，是預(yù)防與控制食源性疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。16SrDNA作為研究分類學(xué)和系統(tǒng)進(jìn)化的分子受到高度重視，16SrDNA為所有細(xì)菌所共有，分子量大小適中便于序列分析；在細(xì)菌的16SrDNA中有多個區(qū)段保守性，根據(jù)這些保守區(qū)可以設(shè)計出細(xì)菌通用物，可以擴(kuò)增出所有細(xì)菌的16SrDNA片段，并且這些引物僅對細(xì)菌是特異性的；而細(xì)菌的16SrDNA可變區(qū)的差異可以用來區(qū)分不同的細(xì)菌，通過對16SrDNA基因序列設(shè)計相應(yīng)核酸探針，對于食品中病原菌的快速診斷具有重要的實(shí)際意義和應(yīng)用價值。
[0003]目前PCR(聚合酶鏈反應(yīng)法)和ELISA (酶聯(lián)免疫法)是目前較常用的食品病原菌快速檢測手段；但是因?yàn)槠鋬烧呔枰ㄟ^一系列復(fù)雜的生化處理過程，操作比較繁瑣，仍未從根本上降低病原菌的檢測時間提高檢測速度，難以滿足實(shí)際快速檢測的要求。實(shí)踐中需要一種更為可靠的新型檢測技術(shù)，電化學(xué)生物傳感檢測技術(shù)作為一種新型檢測技術(shù)在食品致病菌檢測技術(shù)中逐步成為關(guān)注的焦點(diǎn)。
[0004]本發(fā)明針對大腸桿菌16S rDNA的特異性序列區(qū)間，分別合成HRP-Avidin (辣根過氧化物酶-親和素)功能化的DNA檢測探針和生物素化的DNA捕獲探針序列，加入TMB-H2O2 (四甲基聯(lián)苯胺-過氧化氫)后通過HRP對TMB-H2O2催化作用產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)信號，制備出檢測大腸桿菌的DNA電化學(xué)生物傳感器。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的是提供一種可以靈敏、快速及定量檢測大腸桿菌的DNA電化學(xué)生物傳感器及其制備方法，其具體制備步驟如下:
[0006](I)將電極充分打磨清洗后，在電極表面加入11-巰基十一烷酸溶液，然后將電極放入溫箱中孵育后，取出用無水乙醇輕輕清洗，并在氮?dú)庵泻娓伞?br>[0007](3)在電極表面加入EDC[1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺]和NHS (N-羥基丁二酰亞胺)混合液后在室溫下孵育后，用PBS緩沖液清洗，并在氮?dú)庵泻娓?；再分別加入BPA (生物酰胺化親和素)后，在電極表面成功構(gòu)建11-巰基十一烷酸-BPA單分子自組裝層；
[0008](4)在電極表面加入生物素化DNA捕獲探針，孵育后取出用PBS輕輕沖洗，再加入大腸桿菌16S rDNA靶序列待檢液后加入HRP-Avidin功能化的大腸桿菌DNA檢測探針序列，然后放入水浴箱中充分孵育雜交后取出，用PBS緩沖液沖洗，再加入TMB-H2O2后通過HRP對TMB-H2O2催化作用產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)信號；
[0009](5)通過差分脈沖電流圖統(tǒng)計數(shù)據(jù)，根據(jù)所檢測不同濃度的大腸桿菌16S rDNA繪制工作曲線。
[0010]本發(fā)明用于定量檢測大腸桿菌的原理:
[0011]當(dāng)檢測食物標(biāo)本中含有大腸桿菌時，通過處理食物標(biāo)本形成大腸桿菌16S rDNA靶序列待檢液，通過在電極表面構(gòu)建生物素化DNA檢測探針識別層，分別加入待檢液和后HRP-Avidin功能化的DNA檢測探針，待檢液中的大腸桿菌16S rDNA靶序列在孵育過程中被捕獲探針特異性捕獲，在加入TMB-H2O2后，通過HRP-Avidin功能化的檢測探針對TMB-H2O2催化作用產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)，該信號與待檢液中的大腸桿菌16S rDNA靶序列濃度成正比，通過繪制工作曲線，可以對未知食物標(biāo)本中的大腸桿菌進(jìn)行檢測與定量分析。
[0012]本發(fā)明所建立的檢測大腸桿菌的DNA電化學(xué)生物傳感器及其制備方法，其體現(xiàn)的特點(diǎn)是:
[0013](I)從核酸分子檢測大腸桿菌無需細(xì)菌培養(yǎng)，可以避免因長時間細(xì)菌培養(yǎng)所造成的檢測速度緩慢；
[0014](2)采用HRP-TMB-H2O2生物學(xué)信號放大體系，穩(wěn)定性好靈敏度高，無需PCR對靶核酸分子的擴(kuò)增，簡化核酸檢測流程。
【附圖說明】
[0015]圖1是本發(fā)明制備方法中檢測大腸桿菌16S rDNA將核酸雜信息交轉(zhuǎn)換電流信號的差分脈沖圖。
[0016]圖2是本發(fā)明制備方法中檢測不同濃度的大腸桿菌16S rDNA所得的工作曲線。
[0017]圖中數(shù)字代碼表示不同濃度的大腸桿菌16S rDNA，其中1，2為0.0lymol / L ;3，
16為 0.03ymol / L;5，14*0.05ymol / L ;7，8 為 0.10 μ mol / L。
具體實(shí)施方案:
[0018]檢測大腸桿菌的DNA電化學(xué)生物傳感器及其制備方法:
[0019](I)電極表面處理:將電極充分打磨至鏡面光滑后，在雙蒸水中清洗兩次，再放入無水乙醇中超聲清洗5分鐘后取出，烘干Imin ；
[0020](2)在電極表面加入5 μ L0.5mmol / L的11_巰基i^一烷酸溶液，然后將電極放入到充滿氮?dú)獾牡獨(dú)庀渲?8h，然后取出用無水乙醇輕輕清洗30s，并在氮?dú)庵泻娓蒊min ；
[0021](3)在電極表面加入20 μ L EDC和NHS混合液后在室溫下孵育lOmin，用PBS緩沖液清洗，并在氮?dú)庵泻娓蒊min ;再在表面加入5 μ L BPA ;
[0022](4)在電極表面加入2μ L 0.1 μ mol / L的生物素化DNA捕獲探針，孵育1min后取出，用PBS輕輕沖洗5s，再加入食物標(biāo)本中分離的靶序列待檢液，再往電極表面加入I μ L0.1 μ mol / L的HRP-Avidin功能化的大腸桿菌DNA檢測探針序列，然后將電極放入65°C水浴箱中充分孵育雜交40min后取出，用PBS緩沖液沖洗5s，再加入TMB-H2O2 ；
[0023](5)根據(jù)繪制的工作曲線，推算所檢測的未知標(biāo)本是否含有大腸桿菌及其含量濃度。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種檢測大腸桿菌的DNA電化學(xué)生物傳感器及其制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)電極表面11-巰基十一烷酸-BPA單分子自組裝層的制備； (2)電極表面HRP-Avidin功能化的DNA檢測探針和生物素化的DNA捕獲探針及檢測體系的制備； (3)檢測大腸桿菌工作曲線的繪制。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電極表面11-巰基十一烷酸-BPA單分子自組裝層的制備，其特征在于:在打磨處理后的電極表面加入EDC和NHS混合液后在室溫下孵育，用PBS緩沖液清洗，并在氮?dú)庵泻娓珊蠹尤隑PA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電極表面HRP-Avidin功能化的DNA檢測探針和生物素化的DNA捕獲探針及檢測體系的制備，其特征在于: (1)在電極表面加入生物素化DNA捕獲探針，孵育后取出用PBS輕輕沖洗，再加入食物標(biāo)本中分離的大腸桿菌16S rDNA靶序列待檢液； (2)在電極表面再加入HRP-Avidin功能化的大腸桿菌DNA檢測探針序列，然后將修飾后的電極入水浴箱中充分孵育雜交后取出，用PBS緩沖液沖洗，加入ΤΜΒ-Η202。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測大腸桿菌工作曲線的繪制，其特征在于:通過差分脈沖電流圖統(tǒng)計數(shù)據(jù)，根據(jù)所檢測不同濃度的大腸桿菌16S rDNA繪制工作曲線。
【專利摘要】本發(fā)明屬于分析化學(xué)和化學(xué)傳感器技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種檢測大腸桿菌16SrDNA(核糖體DNA)核酸的電化學(xué)生物傳感器及其制備方法，用于檢測大腸桿菌；本發(fā)明針對大腸桿菌16SrDNA的特異性序列區(qū)間，分別合成HRP-Avidin(辣根過氧化物酶-親和素)功能化的DNA檢測探針和生物素化的DNA捕獲探針序列，加入TMB-H2O2(四甲基聯(lián)苯胺-過氧化氫)后通過HRP對TMB-H2O2催化作用產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)信號，制備出檢測大腸桿菌16SrDNA(核糖體DNA)核酸的電化學(xué)生物傳感器。
【IPC分類】G01N27-327, G01N27-26
【公開號】CN104698043
【申請?zhí)枴緾N201310656003
【發(fā)明人】鄭軍, 趙朝輝, 謝國明, 羅鵬
【申請人】重慶醫(yī)科大學(xué)
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2013年12月9日