一種鉑基合金標(biāo)記的三通道夾心型免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米功能材料、免疫分析及生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鉑基合金為標(biāo)記物的三通道夾心型免疫傳感器制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，鉑基合金PtM的研宄得到了很大的發(fā)展，尤其作為低溫燃料電池的最佳催化劑，鉑基合金吸引了研宄者的廣泛興趣。與單一的Pt納米材料相比，摻雜其他金屬合金可以降低Pt的負(fù)載量，從而減少成本，同時(shí)還能保證催化劑活性不變，甚至使活性提高。在電化學(xué)傳感器的構(gòu)建中，也常用到鉑基合金，如鉑金、鉑鈀、鉑銀雙金屬合金，或者鉑基三金屬合金。摻雜了其他貴金屬的合金，在一定程度上提高了催化活性，但成本高昂。而摻雜一些非貴金屬合金，利用Pt良好的生物相容性，以及另一種非貴金屬的電活性，可以從另一方面作為標(biāo)記物構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器。目前，多通道免疫傳感器制備中，大多利用量子點(diǎn)(CdS、ZnS等)、電子媒介體(二茂鐵、甲苯胺藍(lán)、普魯士藍(lán)、硫堇等)及負(fù)載不同金屬離子(Zn2+、Cd2+、Cu2+等)的納米材料作為標(biāo)記物。而利用非貴金屬鉬基合金，如PtZn合金、PtCd合金、PtCu合金為標(biāo)記物的三通道免疫傳感器還未出現(xiàn)。非貴金屬鉑基合金能夠作為信號標(biāo)記物是因?yàn)殡S著納米尺寸的減小，原子逐漸集中到材料表面，因此材料具有很強(qiáng)的電化學(xué)活性。此類鉑基合金的納米材料可以在醋酸-醋酸鈉緩沖液中產(chǎn)生很強(qiáng)的電信號，無需像采用鹽酸或硝酸來處理量子點(diǎn)進(jìn)行洗脫，避免了繁瑣的操作步驟和酸對蛋白質(zhì)分子的危害，減少測定誤差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的之一是提供一種三通道夾心型免疫傳感器的制備方法。
[0004]本發(fā)明的目的之二是將所制備的三通道夾心型免疫傳感器，用于同時(shí)檢測三種分析物。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案，包括以下步驟。
[0006]1.一種鉑基合金標(biāo)記的三通道夾心型免疫傳感器的制備方法
(1)將玻碳電極依次用0.1 Mm,0.05 Mm的氧化鋁粉末打磨拋光，然后用超純水沖洗，除掉表面的雜質(zhì)，完成玻碳工作電極的預(yù)處理；
(2)將3~5μ L、1.0-3.0 mg/mL的Pt-石墨烯水溶液超聲處理分散均勻，然后滴涂在玻碳工作電極表面，自然晾干；
(3)依次將3~5μ?、8~12 Pg/mL分析物a的捕獲抗體、分析物b的捕獲抗體和分析物c的捕獲抗體，分別滴涂到工作電極表面，4 0C冰箱中干燥；
(4)滴涂2~4PL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的牛血清白蛋白于工作電極表面，置于4 °〇冰箱中直至干燥，超純水清洗后，置于4°C冰箱中晾干；
(5)分別滴加不同濃度的分析物a、分析物b和分析物c于工作電極表面； (6)取3~5 μ?三種鉑基合金標(biāo)記的分析物檢測抗體孵化物，分別滴涂于電極表面上，置于4 °C冰箱中晾干，制得一種鉑基合金標(biāo)記的三通道夾心型免疫傳感器。
[0007]2.三種鉑基合金標(biāo)記的分析物檢測抗體孵化物的制備
(I)鉬基合金納米材料的制備
分別向三份已除氧超純水配制的50 mL、0.2~0.3 mmol/L梓檬酸水溶液中，依次加入0.05-0.15 mmol 的 H2PtCl4和 0.015-0.035 mmol 的氯化物溶液，氯化物選自 ZnCl 2或 CdCl2或CuCl2，再分別加入2 mmol的NaBH4,溶液產(chǎn)生大量氣泡，繼續(xù)攪拌2 h，制得黑色鉑基合金納米材料PtZn、PtCd和PtCu，用超純水清洗，干燥備用；
(2 )三種鉑基合金標(biāo)記的分析物檢測抗體孵化物的制備
稱取1.0-3.0 mg鉑基合金納米材料PtZruPtCd和PtCu，分散在0.5 mL、pH=7.4的PBS中，分別加入8~12 μ g的分析物a檢測抗體、分析物b檢測抗體和分析物c檢測抗體，4 °C下孵化12 h，制得三種鉑基合金標(biāo)記的分析物檢測抗體孵化物，通過離心分離除掉未結(jié)合的抗體后，將其分散在I mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1% BSA的PBS中，置于4 °0冰箱備用；
所述鉬基合金標(biāo)記的分析物a檢測抗體孵化物為PtZn/a-Ab ；
所述鉬基合金標(biāo)記的分析物b檢測抗體孵化物為PtCd/b-Ab ；
所述鉬基合金標(biāo)記的分析物c檢測抗體孵化物為PtCu/c-Ab。
[0008]3.三種分析物的同時(shí)檢測步驟
(1)使用電化學(xué)工作站對三電極體系進(jìn)行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的三通道夾心型免疫傳感器為工作電極，在10 mL、pH 4.5-6.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中進(jìn)行測試；
(2)用差分脈沖伏安對分析物進(jìn)行檢測，掃描電壓根據(jù)所選鉑基合金納米材料在-1.2~0.2 V內(nèi)選取，電位增量為0.004 V，振幅0.05 V，脈沖寬度0.2秒，采樣寬度0.0167秒，脈沖周期0.5秒；
(3)鉬基合金標(biāo)記的分析物a檢測抗體孵化物PtZn/a-Ab發(fā)生氧化還原反應(yīng)在-1.1V附近產(chǎn)生信號，鉑基合金標(biāo)記的分析物b檢測抗體孵化物PtCd/b-Ab發(fā)生氧化還原反應(yīng)在-0.75 V附近產(chǎn)生信號，鉑基合金標(biāo)記的分析物c檢測抗體孵化物PtCu/c-Ab發(fā)生氧化還原反應(yīng)在0.0 V附近產(chǎn)生信號，根據(jù)所得電流強(qiáng)度與分析物a、分析物b和分析物c之間的線性關(guān)系，繪制工作曲線。
[0009]4.所述分析物a、分析物b和分析物C，選自以下分析物中的任意三種:癌胚抗原CEA,甲胎蛋白 AFP，IgE, IgG,前列腺特異性抗原 PSA，CA 15-3, CA125，CA 19-9, CA724，CA242，鱗狀細(xì)胞癌抗原SCCA，組織多肽抗原TPA。
[0010]本發(fā)明的有益成果
(1)本發(fā)明首次將鉑基合金納米材料PtZn、PtCd和PtCu應(yīng)用于三通道夾心型免疫傳感器的制備中，鉑基合金納米材料生物相容性好、導(dǎo)電性好、催化性能高，電活性強(qiáng)；
(2)基于PtZn、PtCd和PtCu等三種材料，用相同的修飾方法和檢測方法，利用抗原與抗體的特異性結(jié)合，選擇三種分析物的任意組合，即可實(shí)現(xiàn)高靈敏的同時(shí)檢測，顯著提高了檢測效率。
【具體實(shí)施方式】
[0011]實(shí)施例1 一種鉑基合金為標(biāo)記物的三通道夾心型免疫傳感器制備方法
(1)將玻碳電極依次用0.1 Mm,0.05 Mm的氧化鋁粉末打磨拋光，然后用超純水沖洗，除掉表面的雜質(zhì)，完成玻碳工作電極的預(yù)處理；
(2)將3μ LU.0 mg/mL的Pt-石墨烯水溶液超聲處理分散均勻，然后滴涂在玻碳工作電極表面，自然晾干；
(3)依次將3μ?,8 Pg/mL分析物a的捕獲抗體、分析物b的捕獲抗體和分析物c的捕獲抗體，分別滴涂到工作電極表面，4 0C冰箱中干燥；
(4)滴涂2PU質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的牛血清白蛋白于工作電極表面，置于4 °C冰箱中直至干燥，超純水清洗后，置于4°C冰箱中晾干；
(5)分別滴加不同濃度的分析物a、分析物b和分析物c于工作電極表面；
(6)取3PL三種鉑基合金標(biāo)記的分析物檢測抗體孵化物，分別滴涂于電極表面上，置于4 °C冰箱中晾干，制得一種鉑基合金標(biāo)記的三通道夾心型免疫傳感器。
[0012]實(shí)施例2 —種鉑基合金為標(biāo)記物的三通道夾心型免疫傳感器制備方法
(1)將玻碳電極依次用0.1 Mm,0.05 Mm的氧化鋁粉末打磨拋光，然后用超純水沖洗，除掉表面的雜質(zhì)，完成玻碳工作電極的預(yù)處理；
(2)將4yL、2.0 mg/mL的Pt-石墨烯水溶液超聲處理分散均勻，然后滴涂在玻碳工作電極表面，自然晾干；
(3)依次將4μ?、10 Pg/mL分析物a的捕獲抗體、分析物b的捕獲抗體和分析物c的捕獲抗體，分別滴涂到工作電極表面，4 0C冰箱中干燥；
(4)滴涂3PU質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的牛血清白蛋白于工作電極表面，置于4 °C冰箱中直至干燥，超純水清洗后，置于4°C冰箱中晾干；
(5)分別滴加不同濃度的分析物a、分析物b和分析物c于工作電極表面；
(6)取4PL三種鉑基合金標(biāo)記的分析物檢測抗體孵化物，分別滴涂于電極表面上，置于4 °C冰箱中晾干，制得一種鉑基合金標(biāo)記的三通道夾心型免疫傳感器。
[0013]實(shí)施例3 —種鉑基合金為標(biāo)記物的三通道夾心型免疫傳感器制備方法
(1)將玻碳電極依次用0.1 Mm,0.05 Mm的氧化鋁粉末打磨拋光，然后用超純水沖洗，除掉表面的雜質(zhì)，完成玻碳工作電極的預(yù)處理；
(2)將5HU3.0 mg/mL的Pt-石墨烯水溶液超聲處理分散均勻，然后滴涂在玻碳工作電極表面，自然晾干；
(3)依次將5μ?Λ2 Pg/mL分析物a的捕獲抗體、分析物b的捕獲抗體和分析物c的捕獲抗體，分別滴涂到工作電極表面，4 0C冰箱中干燥；
(4)滴涂4PU質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的牛血清白蛋白于工作電極表面，置于4 °C冰箱中直至干燥，超純水清洗后，置于4°C冰箱中晾干；
(5)分別滴加不同濃度的分析物a、分析物b和分析物c于工作電極表面；
(6)取5PL三種鉑基合金標(biāo)記的分析物檢測抗體孵化物，分別滴涂于電極表面上，置于4 °C冰箱中晾干，制得一種鉑基合金標(biāo)記的三通道夾心型免疫傳感器。
[0014]實(shí)施例4三種鉑基合金標(biāo)記的分析物檢測抗體孵化物的制備 (I)鉬基合金納米材料的制備
分別向三份已除氧超純水配制的50 mL、0.2 mmol/L梓檬酸水溶液中，依次加入0.05mmol的H2PtClJP 0.015 mmol的氯化物溶液，氯化物選自ZnCl 2或CdCl 2或CuCl 2，再分別加入2 mmol的NaBH4,溶液產(chǎn)生大量氣泡，繼續(xù)攪拌2 h，制得黑色鉑基合金納米材料PtZn、PtCd和PtCu，用超純水清洗，干燥備用；
(2 )三種鉑基合金標(biāo)記的分析物檢測抗體孵化物的制備
稱取1.0 mg鉑基合金納米材料PtZn,PtCd和PtCu，分散在0.5 mL、pH=7.4的PBS中，分別加入8 μ g的分析物a檢測抗體、分析物b檢測抗體和分析物c檢測抗體，4 °C下孵化
12h，制得三種鉑基合金標(biāo)記的分析物檢測抗體孵化物