抗癌劑作用增強劑及其應用、以及癌患者預后推定用生物標記物及其應用
【專利說明】抗癌劑作用増強劑及其應用、以及癌患者預后推定用生物 標記物及其應用
[0001] 本申請為專利申請200980133438. 4 (申請日：2009年8月27日，發(fā)明創(chuàng)造名稱： 抗癌劑作用增強劑及其應用、以及癌患者預后推定用生物標記物及其應用）的分案申請。
技術領域
[0002] 本發(fā)明涉及增強抗癌劑的作用的藥劑及其用途、以及癌患者預后推定用生物標記 物及其用途等。
【背景技術】
[0003] 組蛋白去乙?；福℉DACs)通過抑制細胞的增殖、分化、生存而抑制癌的發(fā)生（非 專利文獻1、2)。從過去的研宄已知HDACs的抑制劑（HDACi)在與其他的抗癌劑并用時發(fā)揮 顯著的協(xié)同效果（非專利文獻2、3)。然而，還未完全理解HDACi發(fā)揮協(xié)同效果時的分子機 理。
[0004] 經過系統(tǒng)的活體外（in vitro)研宄慢慢發(fā)現(xiàn)HDACi對腫瘤細胞特異性誘導細 胞增殖的停止、分化、細胞凋亡以及腫瘤血管新生的抑制等（非專利文獻2、3、4)。基于 這種活體外研宄，幾種HDACi在接受臨床實驗，其中之一的伏立諾他（suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)已通過美國食品和藥物管理局（FDA)的許可被應用于皮膚T細胞 性淋巴瘤的治療（非專利文獻4、5)。另外，還報道有HDACi除了單獨的作用之外還通過與 多種作用的抗癌劑并用而發(fā)揮協(xié)同效果（非專利文獻2、4)。而且，已知包括順鉑、5-FU、依 托泊苷（etoposide)、阿霉素（Doxorubicin)等的化學療法劑中，細胞毒性作用的機理之一 是誘導活性氧（R0S)的產生（非專利文獻6~9)。還報道有抗氧化酶或其關聯(lián)基因的表達 的改變將調節(jié)對癌細胞化學療法劑的抵抗性（非專利文獻10~13)，而這將支持上述的利 用化學療法劑的R0S產生的誘導對細胞毒活性重要這一見解。
[0005] 非專利文獻
[0006] 非專利文獻 1:Yang, XJ. and Seto,E. The Rpd3/Hdal family of lysine deacetylases:from bacteria and yeast to mice and men. Nat Rev Mol Cell Biol. 9(3) : 206-18 (2008)
[0007] 非專利文獻 2 : Bo 1 den，JE?，Pear t，MJ. and Johnstone，RW. Anticancer activities of histone deacetylase inhibitors. Nat Rev Drug Discov. 5(9) :769-84(2006).
[0008] 非專利文獻 3:Minucci，S. and Pe lice i，PG. Histone deacety lase inhibitors and the promise of epigenetic (and more)treatments for cancer. Nature Reviews Cancer. 6(1): 38-51 (2006).
[0009] 非專利文獻 4:Xu，WS.，Parmigiani，RB. and Marks，PA. Histone deacetylase inhibitors:molecular mechanisms of action. Oncogene. 26(37):5541-52(2007).
[0010] 非專利文獻 5:Marks，PA. and Breslow，R. Dimethyl sulfoxide to vorinostat:development of this histone deacetylase inhibitor as an anticancer drug. Nature Biotechnology. 25(1):84-90(2007).
[0011] 非專利文獻 6:Miyajima，A. et al. Role of reactive oxygen species in cis -dichlorodiammineplatinum-induced cytotoxicity on bladder cancer cells.Br J Cancer. 76(2):206-10(1997).
[0012] 非專利文獻 7 : Kurosu，T.，F(xiàn)ukuda，T.，Miki，T. and Miura，0? BCL6 overexpression prevents increase in reactive oxygen species and inhibits apoptosis induced by chemotherapeutic reagents in B-cell lymphoma cells. Oncogene. 22(29):4459-68(2003) ?
[0013]非專利文獻 8:Hwang，IT. et al. Drug resistance to 5-FU linked to reactive oxygen species modulator 1. Biochem Biophys Res Commun. 359(2):304-10(2007).
[0014]非專利文獻 9:Ravid，A. et al. 1，25-Dihydroxyvitamin D3 enhances the susceptibility of breast cancer cells to doxorubicin-induced oxidative damage. Cancer Res. 59 (4): 862-7 (1999).
[0015]非專利文獻 10:Godwin，AK. et al. High resistance to cisplatin in human ovarian cancer cell lines is associated with marked increase of glutathione synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 89(7):3070-4 (1992).
[0016] 非專利文獻 11 :Yokomizo, A. et al. Cellular levels of thioredoxin associated with drug sensitivity to cisplatin, mitomycin C, doxorubicin and etoposide. Cancer Res.55 (19):4293-6(1995).
[0017]非專利文獻 12:Sasada，T. et al. Redox control of resistance to cis-diamminedichloroplatinum(II)(CDDP):protective effect of human thioredoxin against CDDP-induced cytotoxicity. J Clin Invest.97 (10):2268-76 (1996).
[0018] 非專利文獻 13:Powis，G. and Kirkpatrick, DL. Thioredoxin signaling as a target for cancer therapy. Curr Opin Pharmacol. 7(4):392-7(2007).
[0019]非專利文獻 14:Halkidou K，Gaughan L，Cook S，Leung HY，Neal DE，Robson CN. (2004). Upregulation and nuclear recruitment of HDAC1 in hormone refractory prostate cancer. Prostate 59:177-189
[0020] 非專利文獻 15:Glozak MA，Seto E. (2007) ? Histone deacetylases and cancer. Oncogene 26:5420-5432
[0021] 非專利文獻 16: Takahashi M，Inaguma Y，Hiai H，Hirose F. (1988). Developmentally regulated expression of a human〃finger〃-containing gene encoded by the 5'half of the ret transforming gene. Mol Cell Biol. 4:1853-6
[0022] 非專利文獻 17: Tezel，G. et al. M. (1999) ? Different nuclear/cytoplasmic distributions of RET finger protein in different cell types.Pathol. Int.49:881-886
[0023]非專利文獻 18 : Takahashi，M. and Cooper，G. M. : ret transforming gene encodes a fusion protein homologous to tyrosine kinases. Mol. Cell. Biol. 7, 1378-1385(1987)
[0024]非專利文獻 19:Shimono, Y.，Murakami，H.，Hasegawa，Y. and Takahashi，M.:RFP is a transcriptional repressor and interacts with enhancer of polycomb that has dual transcriptional functions. J. Biol Chem. 275:39411-39419. (2000)
[0025]非專利文獻 20:Shimono, Y.，Murakami，H.，Kawai，K.，Wade，P. A.，Shimokata，K. and Takahashi，M. :Mi_2 associates with BRG1 and RET finger protein at the distinct regions with transcriptional activating and repressing abilities. J. Biol. Chem. 278:51638-51645(2003)
[0026]非專利文獻 21: Shimono, K.，Shimono, Y.，Shimokata，K.，Ishiguro, N.，and Takahashi，M. :Microspherule protein 1, Mi-2 0 , and RET finger protein associate in the nucleolus and up-regulate ribosomal gene transcription. J. Biol. Chem. 280:39436-39447(2005)

【發(fā)明內容】

[0027] 在癌治療中并用多個抗癌劑的情況較多?？拱﹦┑牟⒂檬且蕴岣咧委熜Ч麨槟康?進行的，但有時帶來嚴重的副作用。其原因在于現(xiàn)在使用的抗癌劑的大部分以增殖迅速的 細胞作為靶，對癌細胞以外的正常的細胞也起到細胞損傷作用。
[0028] 本發(fā)明在如上的背景下，以提供增強抗癌劑的作用的手段，或提供對把握癌患者 的預后有用的生物標記物及其用途，從而達成提高癌的治療效果為課題。
[0029] 到目前為止已知HDACi將改變控制細胞內氧化狀態(tài)的硫氧還蛋白 (Thioredoxin)、TBP-2的表達。鑒于該事實，本發(fā)明人建立如下假說：HDACi通過控制細 胞內的抗氧化機理而使癌細胞變?yōu)榭拱﹦┟舾行?。為了證實該假說，著眼于具有（1)在 人的腫瘤中呈高表達，（2)控制細胞的增殖、分化、生存這樣特征（Halkidou K，Gaughan L, Cook S, Leung HY, Neal DE, Robson CN. (2004). Upregulation and nuclear recruitment of HDACI in hormone refractory prostate cancer. Prostate 59:177-189 (非專利 文獻 14) ；Glozak MA, Seto E. (2007). Histone deacetylases and cancer. Oncogene 26:5420-5432(非專利文獻15))的HDACI，和具有（1)在癌細胞株中有高表達，（2)活 體內的表達有局限性這樣的特征（了81^1^8111]\1，11^81111^￥，]^3；[11，11；[1'086?.(1988). Developmentally regulated expression of a human〃:finger〃-containing gene encoded by the 5'half of the ret transforming gene. Mol Cell Biol. 4:1853-6 (非專利文獻 16) ；Tezel, G. et al. M. (1999). Different nuclear/cytoplasmic distributions of RET finger protein in different cell types. Pathol. Int. 49:881-886 (非專利文獻 17)) 之上還具有（3)其敲除（knockout)鼠不顯示嚴重的表型這樣的特征（未發(fā)表數(shù)據(jù)）的 (RET finger protein)，進行了深入的研宄。其結果發(fā)現(xiàn) HDAC1 對 Thioredoxin Binding Protein-2 (TBP-2)的表達進行負控制，從而增進對癌細胞氧化應激的抵抗性。另外，還發(fā) 現(xiàn)HDAC1通過由RFP以及轉錄因子NF-Y構成的蛋白復合體而被配置于TBP-2基因的啟動 子上。另外，還發(fā)現(xiàn)使用RNAi的RFP的表達抑制將招致該蛋白復合體的降解，結果顯著增 大癌細胞的順鉑（抗癌劑，也是氧化應激的誘導劑）敏感性。這些事實表明RFP是癌細胞 獲得抗癌劑耐性的重要的控制因子，還表明抑制RFP的表達或作用，則介由抗癌劑的作用 的增強，可提高癌治療結果。
[0030] 另一方面，還發(fā)現(xiàn)RFP的高表達，與人的大腸癌的TBP-2的表達下降、大腸癌患者 的預后不良相關。這表示使用抗癌劑時抑制RFP的表達或作用這一治療對策的有效性，還 表明檢查癌細胞的RFP的表達水平則能判定對抗癌劑的耐性，而該判定結果將成為對確定 治療方針（有效的治療法的選擇等）、改善預后、提高患者生存質量（QOL)等有貢獻的有益 信息。進一步研宄的結果還發(fā)現(xiàn)RFP的表達與子宮體癌的預后不良相關。引人注意的是得 到了如下的見解：在發(fā)現(xiàn)RFP的高表達時，采用通過更積極的手術方式的舉措將改善預后。 如上所述，表明RFP作為癌患者的預后推定用生物標記物（指標）有用。尤其是表明在子 宮體癌中，RFP的表達將成為決定手術方式時的有益的指標。
[0031] 本發(fā)明主要是以上述的見解以及成果為基礎，內容如下。
[0032] [1] 一種作用增強劑，是具有氧化應激誘導效力的抗癌劑的作用增強劑，其中，以 抑制RFP (RET finger protein)基因的表達或RFP的作用的化合物為有效成分。
[0033] [2]如[1]所述的作用增強劑，其中，所述化合物是選自以下的（a)~⑷中的化 合物：
[0034] (a)以RFP基因作為靶的siRNA ;
[0035] (b)在細胞內生成以RFP基因作為靶的siRNA的核酸構建物；
[0036] (c)以RFP基因的轉錄產物作為靶的反義核酸；
[0037] (d)以RFP基因的轉錄產物作為靶的核酶。
[0038] [3]如[1]或[2]所述的作用增強劑，其中，與具有氧化應激誘導效力的抗癌劑并 用。
[0039] [4] 一種增強具有氧化應激誘導效力的抗癌劑的作用的方法，包括：在靶癌細胞 內，抑制RFP基因的表達或RFP的作用的步驟。
[0040] [5] -種癌治療法，包括：將[1]或[2]所述的作用增強劑給藥的步驟和將具有氧 化應激誘導效力的抗癌劑給藥的步驟。
[0041] [6] -種抗癌劑耐性檢測法，包括：檢查從活體分離的癌細胞內的RFP表達量的步 驟，和
[0042] 基于所述步驟的結果，判定對具有氧化應激誘導效力的抗癌劑的所述癌細胞的耐 性的步驟。
[0043] [7] -種癌患者的預后推定用生物標記物，包含RFP。
[0044] [8]如[7]所述的預后推定用生物標記物，其中，癌為大腸癌或子宮體癌。
[0045] [9] 一種癌患者的預后推定法，其中，以從癌患者分離的癌細胞內的RFP表達量為 指標。
[0046] [10]如[9]所述的預后推定法，其中，癌細胞內的RFP表達量多是表示預后不良。
[0047