用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病的生物診斷標記物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)療領域，具體是用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病的生物診斷標記物。
【背景技術】
[0002] 視神經(jīng)屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其神經(jīng)纖維由少突膠質細胞組成的髓鞘所包裹。少突 膠質細胞凋亡常引起0N(0ptic neuritis，視神經(jīng)炎），是一種累及視神經(jīng)進而導致軸突損 傷的炎性脫髓鞘疾病。
[0003] 0N是CIS (Clinically isolated syndrome,臨床孤立綜合征）的一種類型，在臨 床上，CIS病人可以進展為MS(Multiple sclerosis，多發(fā)性硬化）或NMO(Neuromyelitis optica,視神經(jīng)脊髓炎）等CNS(Central nervous system,中樞神經(jīng)系統(tǒng)）脫髓鞘疾病。在 脫髓鞘疾病中，CNS不但存在髓鞘的脫失，也存在軸索的損傷，就MS和NM0而言，NM0的病理 學損傷在軸索上更為明顯，特別是AQP4蛋白密集區(qū)域。在疾病早期，特別是0N初次發(fā)作的 時候，AQP4-Ab，CSF-0CB等免疫指標為疾病的進展提供了一個很好的參考標準。但是由于 隨訪時間、個體差異等因素，在0N首次發(fā)作后，疾病的預后和轉歸尚不能有較為合適的生 物學指標作為參照。
[0004]西方國家報道以 ID0N(Idiopathic demyelinating optic neuritis，特發(fā)性脫髓 鞘性視神經(jīng)炎）最為常見，該種類型的ON與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病MS關系密切，0NTT研究小 組經(jīng)過長達15年的研究發(fā)現(xiàn)，成人患者中有近50%的孤立視神經(jīng)炎患者（72%發(fā)病時顱腦 MRI陽性，25%發(fā)病時顱腦MRI陰性）最終轉化為MS。而在亞洲國家，關于NM0的報道較多。 很長一段時間，對NM0是獨立的疾病或MS亞型一直是有爭議的，近些年的研究發(fā)現(xiàn)血清中 AQP4(Aquaporin-4,水通道蛋白4)抗體是NM0較為特異的一項指標，在NM0診斷中有較高 的敏感性（68-91% )和特異性（85-99% )。NM0除了部分原發(fā)進展型（10% )之外，多由反 復發(fā)作的ID0N發(fā)展而來（90% )。這部分最終發(fā)展為NM0的0N患者，在視神經(jīng)脊髓炎首次 發(fā)病的過程中，其臨床表現(xiàn)和普通的0N極為相似。同時由于這部分0N患者血清中AQP4抗 體的陽性率很低，僅約3-5%，因此并不能依靠AQP4抗體檢測預判其疾病的轉歸。鑒于此， 尋找新特異有效的生物學標記物及阻礙疾病髓鞘再生機制顯得尤為重要。
[0005] 髓鞘再生是中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘性疾病發(fā)生后的重要修復方式，主要由 0PCs(01igodendrocyte precursor cells,少突膠質前體細胞）增殖分化形成具有功能 性的少突膠質細胞，包繞軸突，重新執(zhí)行神經(jīng)纖維的傳導和神經(jīng)元的保護、營養(yǎng)等功能。 但是在部分0N和NM0等脫髓鞘疾病中，髓鞘的再生明顯被抑制，這可能是因為促進髓鞘 修復的因子的缺乏和/或抑制髓鞘修復的因子的增加，而導致〇PCs在病變部位成熟化 (maturation)失敗，使髓鞘再生受阻。
[0006] 從上世紀末至今，有關MS和NM0生物標記的研究，為兩種疾病的臨床診斷、鑒別及 治療提供了重大支持。然而作為這兩種CNS脫髓鞘疾病的一部分，在臨床上首次發(fā)作的0N， 其疾病走勢仍是臨床及科研工作中的一大難題。目前NM0的重要診斷指標AQP4-Ab往往在 患者還處在0N階段時無法檢出。但是其他一些因子，尤其是與神經(jīng)髓鞘再生相關的細胞因 子，在近年來的研究中越來越受到重視。這些因子包括血小板衍生因子、趨化因子12和趨 化因子14。
[0007] CXCL12(C-X-C motif ligand 12,趨化因子 12)又名基質細胞衍生因子 l(SDF-l)， 屬于CXC類趨化因子家族。CXCL12與CXCR4具有高度親和力，二者形成的CXCL12/CXCR4軸 在免疫介導及炎癥反應、HIV感染、惡性腫瘤的侵潤轉移等過程中起到重要作用。近年來， Patel等人研究發(fā)現(xiàn)在脫髓鞘實驗動物模型中阻斷CXCL12/CXCR4信號通路減弱受損的中 樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘再生，這提示CXCL12可能參與調節(jié)OPCs遷移、增殖或分化形成少突膠質 細胞的過程。另有研究顯示，基因敲除CXCR4的動物在脫髓鞘模型中出現(xiàn)髓鞘修復障礙，并 發(fā)展成為慢性脫髓鞘。可見，CXCL12在對抗中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病，并參與髓鞘修復的過 程中起著至關重要的作用。另外，Tanegashima等人發(fā)現(xiàn)，另一個CXC類趨化因子家族成員 CXCL14(C-X-C motif ligand 14,趨化因子14)可以競爭性結合CXCR4,從而阻斷CXCL12/ CXCR4信號通路。在動物實驗中，roGFplatelet derived growth factor,血小板衍生因 子）可以調節(jié)OPCs向脫髓鞘部位遷移，促進慢性脫髓性疾病的髓鞘再生。
[0008] 但是截止到目前，PDGF、CXCL12、CXCL14在0N中的變化尚不清楚，因此檢測TOGF、 CXCL12和CXCL14在ON患者腦脊液中的變化，有可能找到新的診斷和轉歸判斷的生物學標 記，并有可能進一步揭示視神經(jīng)炎發(fā)病和恢復的生理機制。

【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病的生物診斷標記物，以解決 上述【背景技術】中提出的問題。
[0010] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：
[0011] 用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病的生物診斷標記物，所述生物診斷標記物是腦脊液 中血小板衍生因子、趨化因子12和趨化因子14。
[0012] 作為本發(fā)明進一步的方案：中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病包括視神經(jīng)炎0N和視神經(jīng) 脊髓炎NM0,且在視神經(jīng)炎0N的不同階段，還能通過監(jiān)測腦脊液中血小板衍生因子和趨化 因子12評估其病情變化，判斷預后情況。
[0013] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明通過檢測0N和NM0患者腦脊液中 CXCL12、PDGF及CXCL14的水平和變化，發(fā)現(xiàn)了 0N和NM0新的生物學標記物，評估其髓鞘再 生能力，為0N和NM0的預后及轉歸提供實驗依據(jù)，并為其治療提供新的思路。
【附圖說明】
[0014] 圖1是各組患者腦脊液CXCL12、PDGF及CXCL14水平（x土s，ng/ml)比較圖，其中 < 0. 05, #P < 0. 01，< 0. 001 ;
[0015] 圖2是ON不同發(fā)病時期CXCL12、PDGF水平（x土s，ng/ml)比較圖，其中*P<0.05， **P < 0. 01, < 0. 001 ;
[0016]圖 3 是MRI 分組 CXCL12、PDGF 水平（x土s，ng/ml)的比較圖，其中林P < 0? 01， _P < 0? 001 ;
[0017] 圖4是腦脊液CXCL12與TOGF的關系圖。
【具體實施方式】
[0018] 下面將結合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的 實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都 屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0019] 實施例1
[0020] 1 實驗
[0021] 1.1研究對象
[0022] 選取2012年9月至2013年9月期間就診于解放軍總醫(yī)院神經(jīng)眼科的55名患者。 其中0N患者35人（以本次發(fā)病后4周為節(jié)點，分為急性期組18人及平穩(wěn)期組17人），NM0 患者10人作為實驗組。ON符合美國0NTT研究小組提出的視神經(jīng)炎診斷標準。NM0則符合 Wingerchuk 等人提出的診斷標準。選取 CVST(Cerebral venous sinus thrombosis，盧頁內 靜脈竇血栓形成）患者10人作為對照組，并且在性別、年齡上與0N、NM0組相匹配。所有受 試者年齡均> 16歲，至少有3個月沒有激素、免疫抑制劑或免疫調節(jié)劑治療史，排除感染性 視神經(jīng)炎及其他眼部疾病和全身性疾病。
[0023] 1. 2臨床資料及標本的收集
[0024] 受試者均接受系統(tǒng)的眼科檢查，包括最佳矯正視力、裂隙燈檢查、直接及間接檢 眼鏡檢查、Goldmann眼壓檢測等。入院后行血清學檢查和腰椎穿刺術檢查，腦脊液除行常 規(guī)（白細胞計數(shù)）、生化（蛋白質、葡萄糖）及免疫（IgG、IgA、IgM)檢測外，留取第3管腦 脊液3ml，500iil/EP管分裝后立即置于-80°C冰箱中保存。對于CVST的患者還需結合顱 腦MRV或者DSA檢查除外其他疾病。視神經(jīng)炎及NM0的患者還需進行系統(tǒng)的神經(jīng)內科查 體，必要時行眼眶、頡腦及頸胸椎MRI檢查、視覺誘發(fā)電位（VEP)、0CT(0pticai coherence tomography,光學相干斷層掃描）、ERG(Electroretinogram，視網(wǎng)膜電流圖）等以明確診 斷。
[0025]1?3 CXCL12、PDGF 及 CXCL14 檢測
[0026] 三種細胞因子均采用ELISA方法檢測，最后以空白孔調零，450nm波長依序測量各 孔的吸光度（0D值）。根據(jù)標準品的濃度及對應的0D值計算出標準曲線的回歸方程（R 2> 〇. 98)，再根據(jù)樣品的0D值計算出對應的樣品濃度。
[0027] L 4統(tǒng)計學方法
[0028] 采用SPSS 19. 0及GraphPad Prism5. 0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，正態(tài)性檢驗采 用Kolmogorov-Smirnov檢驗，患者年齡及腦脊液白細胞計數(shù)、蛋白質含量、葡萄糖、IgG、 1 8八、1§1、0乂(^12、1^?、0乂(^14水平均為正態(tài)分布計量資料，用均數(shù)±標準差（1±8)表示。 用單因素方差分析（AN0VA)比較不同疾病和不同時期患者CSF中CXCL12、TOGF及CXCL14 水平，組間的兩兩比較采用LSD法。0N不同發(fā)病時期MRI陽性率的比較采用Pearson卡方 檢驗。同時分別對CXCL12、H)GF水平與白細胞數(shù)、IgG含量及蛋白質含量進行Pearson相 關性分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
[0029] 2數(shù)據(jù)分析
[0030] 2. 1受試者的基本情況
[0031]0N組共有35例，其中男10例（28. 57%)，女25例（71. 43%)，男女之比1 : 2. 5， 年齡16-58歲，平均年齡33. 97±11. 65歲。NMO組共有10例，其中女性8例（80. 00% )， 平均年齡38. 90 ± 13. 69歲，較ON組年齡大，但差異無統(tǒng)計學意義。CSF檢查中白細胞計數(shù) NM0組高于ON組和CVST組（P = 0. 005及P = 0. 009)。9名NM0患者中，有4名IgG含量 高于正常值，平均含量為3. 46± 1. 83mg/dl，高于其他各組（P = 0. 020及P = 0. 039)。其 它檢測結果詳見表1。
[0032] 表1患者的基本情況表
[0033]
【主權項】
1. 用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病的生物診斷標記物，其特征在于，所述生物診斷標記 物是腦脊液中血小板衍生因子、趨化因子12和趨化因子14。
2. 根據(jù)權利要求1所述的用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病的生物診斷標記物，其特征在 于，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病包括視神經(jīng)炎ON和視神經(jīng)脊髓炎NMO,且在視神經(jīng)炎ON 的不同階段，還能通過監(jiān)測腦脊液中血小板衍生因子和趨化因子12評估其病情變化，判斷 預后情況。
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病的生物診斷標記物，所述生物診斷標記物是腦脊液中血小板衍生因子、趨化因子12和趨化因子14。中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病包括視神經(jīng)炎ON和視神經(jīng)脊髓炎NMO，且在視神經(jīng)炎ON的不同階段，還能通過監(jiān)測腦脊液中血小板衍生因子和趨化因子12評估其病情變化，判斷預后情況。本發(fā)明通過檢測ON和NMO患者腦脊液中血小板衍生因子、趨化因子12和趨化因子14的水平和變化，發(fā)現(xiàn)了ON和NMO新的生物學標記物，評估其髓鞘再生能力，為ON和NMO的預后及轉歸提供實驗依據(jù)，并為其治療提供新的思路。
【IPC分類】G01N33-68
【公開號】CN104698190
【申請?zhí)枴緾N201510112323
【發(fā)明人】魏世輝, 陳霆雋, 李朝輝
【申請人】中國人民解放軍總醫(yī)院
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年3月16日