與結(jié)直腸癌顯著相關(guān)的血清多肽生物標(biāo)志物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物標(biāo)志物檢測(cè)，具體地說，涉及一種與結(jié)直腸癌顯著相關(guān)的血清多 肽生物標(biāo)志物及其應(yīng)用
【背景技術(shù)】
[0002] 大腸癌早期診斷方法主要依賴于分子生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)血液和糞便進(jìn)行無創(chuàng)或微 創(chuàng)檢測(cè)。多種基因的表達(dá)或變異被發(fā)現(xiàn)與大腸癌發(fā)病相關(guān)，包括P53基因突變和p53蛋白 質(zhì)過度表達(dá)、K-ras基因突變、細(xì)胞色素D1表達(dá)、BCL-2基因重排、端粒酶家族基因hTERT過 度表達(dá)有關(guān)；此外，APC和MCC基因突變、C-myc基因的過度表達(dá)、pl6基因突變、⑶44基因 的異常表達(dá)等都與大腸癌有關(guān)。繼基因表達(dá)和變異之后，多種蛋白質(zhì)腫瘤標(biāo)志物也被發(fā)現(xiàn) 與大腸癌發(fā)病相關(guān)。
[0003] 腫瘤標(biāo)志物在腫瘤診斷和個(gè)性化醫(yī)療中起重要作用，然而既望的腫瘤標(biāo)志物不能 同時(shí)具有高敏感性和特異性。譬如，糖類抗原19-9 (Casbohydrate Antigen CA19-9)是一 種腫瘤相關(guān)抗原，對(duì)大腸癌的診斷敏感度56. 7%，特異度89. 7%。CA242是一種唾液酸化糖 類抗原，其靈敏度60. 0 %，特異度95. 4 %。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種與結(jié)直腸癌顯著相關(guān) 的血清多肽生物標(biāo)志物，其聯(lián)合使用可以實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)直腸較準(zhǔn)確的診斷。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明首先提供與結(jié)直腸癌顯著相關(guān)的血清多肽生物標(biāo) 志物，所述生物標(biāo)志物由7個(gè)具有以下質(zhì)荷比的人血清蛋白組成：1061. 10m/z、1213. 09m/ z、1607. 32m/z、1867. 02m/z、1897. 95m/z、2011. 67m/z 和 5078. 81m/z。
[0006] 本發(fā)明還提供了由前述生物標(biāo)志物組成的質(zhì)譜模型。
[0007] 本發(fā)明還提供了所述質(zhì)譜模型的制備方法，具體包括如下步驟：
[0008] 1)收集多例臨床確診的結(jié)直腸癌患者血清和健康對(duì)照人員的血清作為兩組血清 標(biāo)本，進(jìn)行低溫冷凍備用；
[0009] 2)對(duì)血清蛋白進(jìn)行質(zhì)譜前預(yù)處理；
[0010] 3)對(duì)預(yù)處理過的兩組血清蛋白進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定，獲 得多肽質(zhì)譜圖；
[0011] 4)分析多肽質(zhì)譜圖，篩選出具有下列質(zhì)荷比峰的7個(gè)結(jié)直腸癌特征血清蛋白： 1061. 10m/z、1213. 09m/z、1607. 32m/z、1867. 02m/z、1897. 95m/z、2011. 67m/z 和 5078. 81m/ z ；
[0012] 5)將上述7個(gè)結(jié)直腸癌特征血清蛋白作為結(jié)直腸癌標(biāo)志物，建立用于檢測(cè)結(jié)直腸 癌的質(zhì)譜模型。
[0013] 進(jìn)一步地，所述步驟2)包括使用磁珠純化和穩(wěn)定樣品中的血清蛋白或多肽。
[0014] 本發(fā)明還提供了前述生物標(biāo)志物在建立檢測(cè)結(jié)直腸癌的質(zhì)譜模型中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0016] 本發(fā)明運(yùn)用Clinprot技術(shù)（液體芯片-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)）對(duì)大腸癌患者和健康 對(duì)照組的血清多肽譜進(jìn)行分析，該系統(tǒng)由磁珠分離系統(tǒng)、質(zhì)譜系統(tǒng)、分析軟件和可選的液體 樣品自動(dòng)處理系統(tǒng)四部分組成，可以對(duì)血液等液體中低分子量的蛋白/多肽有效富集和分 析，篩選出差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的多肽峰，敏感性、重復(fù)性和特異性均較好。篩選出的顯著 差異多肽對(duì)大腸癌臨床診斷和治療提供新的理想腫瘤標(biāo)志物有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià) 值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)質(zhì)荷比（m/z)分別為 1061. 10、1213. 09、1607. 32、1867. 02、1897. 95、201L 67 和5078. 81與結(jié)直腸癌顯著相關(guān)，其聯(lián)合使用對(duì)結(jié)直腸癌區(qū)分的靈敏度為96. 3% -99. 3%， 特異度為95. 7% -98. 7%。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0018] 實(shí)施例1
[0019] 1、研宄對(duì)象
[0020] 研宄中111例健康組人員來自在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院進(jìn)行常規(guī)體檢 的人群。選入標(biāo)準(zhǔn)為：（1)病歷中無軀體疾病或精神異常史；（2)兩周內(nèi)無服藥史。將明確 診斷為嚴(yán)重的心血管、呼吸、泌尿、消化和血液系統(tǒng)具體疾病的個(gè)體予以排除。94例大腸癌 患者組來自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院明確診斷為大腸癌的病人。大腸癌的診斷以病 理診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，排除患有或曾患糖尿病、心腦血管、肝臟、腎臟、代謝性疾病以及其它腫瘤 等重要疾病人群。所有研宄對(duì)象均簽署知情同意，本研宄經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批 準(zhǔn)通過。
[0021] 2、血漿樣品
[0022] 供分析使用的血漿樣品根據(jù)自愿原則，靜脈穿刺收集清晨空腹血液，37°C環(huán)境中 半小時(shí)凝血。采集的血液以3000r/min離心15分鐘分離血清并在-80°C下保存以供蛋白組 學(xué)分析使用。
[0023] 3、血漿的磁珠預(yù)處理
[0024] 根據(jù) ClinProtTM 供應(yīng)商（Bruker Daltonics, Billerica, USA)提供的說明，將 所有血漿樣品使用弱陽離子交換磁珠（MB-WCX)進(jìn)行分離。通過結(jié)合、洗滌和洗脫三個(gè)步 驟對(duì)樣品進(jìn)行純化和分離。首先，在試管中加入10 y 1磁珠、10 y 1 MB-WCX結(jié)合液（BS) 和5yl血樣，充分混合并放置五分鐘。第二步，將試管放置在磁珠分離裝置上（Bruker Daltoni CS，BilleriCa，USA) -分鐘，使磁珠吸附在管壁上。然后取出上清，加入100yl磁 珠洗滌液（WS)充分混勻。洗滌三次后取出上清，加入5 y 1磁珠洗脫液（ES)，在分離裝置上 洗脫管壁上的磁珠兩分鐘。將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的試管中，加入5ul磁珠固定液（SS)充 分混合。由此產(chǎn)生的洗脫液在-20°C下儲(chǔ)存。
[0025] 4、AnchorChip革巴芯片點(diǎn)樣和蛋白質(zhì)分析
[0026] 用2:1乙醇和丙酮溶液當(dāng)天配置0.3g/L的a-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)溶液，用 該基質(zhì)溶液按1:10比例稀釋洗脫的樣品。例如，在10 U 1的基質(zhì)溶液中加入1 U 1的洗脫 液，取出1 y 1混合液點(diǎn)在基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS)樣品靶上 (AnchorChipTM，Bruker Daltonics，Billerica，USA)，在室溫下干燥后進(jìn)行分析。使用美 國布魯克道爾頓公司的Autoflex飛行時(shí)間設(shè)備進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 測(cè)定。出于質(zhì)量控制的目的，用11個(gè)平均分子質(zhì)量偏差不超過l〇〇ug/g的肽作為外部標(biāo)準(zhǔn) 制劑，數(shù)據(jù)采集前該標(biāo)準(zhǔn)制劑在每第八個(gè)樣品上進(jìn)行了再次校準(zhǔn)。另外，用13個(gè)參考血樣 作為外部標(biāo)準(zhǔn)，變異系數(shù)小于30%即表示系統(tǒng)性能可接受。每個(gè)樣品平均激光照射400次， 每個(gè)靶位轟擊100下，轟擊四個(gè)不同的區(qū)域，檢測(cè)范圍為600-10000Da，獲得多肽質(zhì)譜圖。
[0027] 5、統(tǒng)計(jì)分析
[0028] 用ClinProTools2. 0軟件對(duì)樣本原始質(zhì)譜圖（使用總離子流）正式分析前，先進(jìn) 行基線消減、校正和歸一化，確定檢測(cè)范圍為600-10000Da，設(shè)置信噪比（S/N)大于5,質(zhì)量 范圍不大于〇. 1%。以峰面積作為定量標(biāo)準(zhǔn)，將兩組間相關(guān)峰值水平的比較，篩選出大腸癌 血清顯著差異多肽峰。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS13. 0軟件，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)分析使用獨(dú) 立樣本t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的連續(xù)數(shù)據(jù)使用Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)。采用Logistic 回歸分析向前條件似然比法（forward conditional)，以選入界值a彡〇.〇5、剔除界值 a多0. 10為標(biāo)準(zhǔn)，分析性別、年齡以及篩選出的115個(gè)顯著差異多肽峰中對(duì)發(fā)生大腸癌的 危險(xiǎn)因素。P〈〇. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0029] 采用多元Logistic回歸建立診斷模型（回歸方程為Logit P = -34. 444+0. 998x2 -0? 086x10+0. 185x16-0. 454x23+0. 430x26+0. 068x28-0. 050x31-0. 221x79,其中自變量分 別為質(zhì)荷比（m/z) 1061. 10、1213. 09、1607. 32、1867. 02、1897. 95、201L 67 和 5078. 81 的多 肽），該對(duì)結(jié)直腸癌區(qū)分的靈敏度為96. 3% -99. 3%，特異度為95. 7% -98. 7% (見表1)。
[0030] 表1 :診斷模型對(duì)結(jié)直腸癌的診斷效果
[0031]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 與結(jié)直腸癌顯著相關(guān)的血清多肽生物標(biāo)志物，其特征在于，所述生物標(biāo)志物由7個(gè) 具有以下質(zhì)荷比的人血清蛋白組成：1061. 10m/z、1213. 09m/z、1607. 32m/z、1867. 02m/z、 1897. 95m/z、2011. 67m/z和 5078. 81m/z。
2. 由權(quán)利要求I所述的生物標(biāo)志物組成的質(zhì)譜模型。
3. 權(quán)利要求2所述質(zhì)譜模型的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步驟： 1) 收集多例臨床確診的結(jié)直腸癌患者血清和健康對(duì)照人員的血清作為兩組血清標(biāo)本， 進(jìn)行低溫冷凍備用； 2) 對(duì)血清蛋白進(jìn)行質(zhì)譜前預(yù)處理； 3) 對(duì)預(yù)處理過的兩組血清蛋白進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定，獲得多 肽質(zhì)譜圖； 4) 分析多肽質(zhì)譜圖，篩選出具有下列質(zhì)荷比峰的7個(gè)結(jié)直腸癌特征血清蛋白： 1061. 10m/z、1213. 09m/z、1607. 32m/z、1867. 02m/z、1897. 95m/z、2011. 67m/z和 5078. 81m/ z； 5) 將上述7個(gè)結(jié)直腸癌特征血清蛋白作為結(jié)直腸癌標(biāo)志物，建立用于檢測(cè)結(jié)直腸癌的 質(zhì)譜模型。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟2)包括使用磁珠純化和穩(wěn) 定樣品中的血清蛋白或多肽。
5. 權(quán)利要求1所述的生物標(biāo)志物在建立檢測(cè)結(jié)直腸癌的質(zhì)譜模型中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了與結(jié)直腸癌顯著相關(guān)的血清多肽生物標(biāo)志物，其由7個(gè)具有以下質(zhì)荷比的人血清蛋白組成：1061.10m/z、1213.09m/z、1607.32m/z、1867.02m/z、1897.95m/z、2011.67m/z和5078.81m/z。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)上述生物標(biāo)志物聯(lián)合使用對(duì)結(jié)直腸癌區(qū)分的靈敏度為96.3％-99.3％，特異度為95.7％-98.7％。
【IPC分類】G01N33-68, G01N27-62
【公開號(hào)】CN104698192
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510148501
【發(fā)明人】王友信, 王嵬, 于鑫瑋, 蓋思齊, 房紅紅
【申請(qǐng)人】首都醫(yī)科大學(xué)
【公開日】2015年6月10日
【申請(qǐng)日】2015年3月31日