糖蛋白酶介導(dǎo)位點(diǎn)特異性放射性標(biāo)記的方法和組合物的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)應(yīng)用
[0002] 本申請(qǐng)享有于2012年10月25日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)61/718, 562號(hào)的利益，該 專利公開的內(nèi)容通過引用而納入到本申請(qǐng)中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及糖蛋白位點(diǎn)特異性放射性標(biāo)記領(lǐng)域。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 抗體顯著的特異性、親和力和穩(wěn)定性使其成為向腫瘤輸送診斷性和治療性放射性 同位素的極有前景的載體。實(shí)際上，在過去二十年內(nèi)，攜帶放射性核素 124I、mIn，及64Cu的 用于PET及SPECT成像的抗體，以及攜帶放射性核素9°Y、mLu，和225Ac的用于放射治療的抗 體已經(jīng)在臨床中得到應(yīng)用。
[0006] 但是，放射性免疫偶聯(lián)物的開發(fā)和轉(zhuǎn)化潛在的一種局限性是抗體放射性標(biāo)記缺乏 位點(diǎn)特異性。絕大多數(shù)抗體放射性標(biāo)記方法依賴于與氨基酸殘基的反應(yīng)，典型的氨基酸是 用于放射性碘標(biāo)記的酪氨酸或用于放射性金屬螯合劑偶聯(lián)的賴氨酸或半胱氨酸。而且，抗 體當(dāng)然是非常大的分子，因此，抗體具有每種氨基酸的多個(gè)復(fù)制氨基酸。因此，無法精確控 制抗體上放射性核素或放射性金屬_螯合劑絡(luò)合物的特異性分子位置。
[0007] 缺少放射性標(biāo)記位點(diǎn)特異性，給放射性免疫偶聯(lián)物的開發(fā)和使用帶來了兩種主要 的復(fù)雜性。首先，不能控制抗體上的放射性標(biāo)記的精確位置，放射性同位素或放射性金屬螯 合物最后可能是附加到抗體的抗原結(jié)合區(qū)，對(duì)構(gòu)建體的免疫反應(yīng)性造成不利影響。其次，不 了解放射性標(biāo)記的準(zhǔn)確位置，得到的放射性免疫偶聯(lián)物在某種程度上未適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行化學(xué)定 義，這在基礎(chǔ)科學(xué)研究中（也許更重要的是在臨床管理審查和批準(zhǔn)過程中）是一個(gè)問題。
[0008] 此外，缺乏由直接標(biāo)記反應(yīng)或螯合劑偶聯(lián)策略所提供的重現(xiàn)性，對(duì)于目前放射性 免疫偶聯(lián)物的構(gòu)建策略來說，是另一個(gè)令人煩惱的局限性。鑒于大多數(shù)放射性標(biāo)記方法的 非位點(diǎn)選擇性性質(zhì)，為了取得能在最終的放射性免疫偶聯(lián)物的特異性活動(dòng)及其免疫反應(yīng)性 之間實(shí)現(xiàn)適當(dāng)平衡的標(biāo)記度，每種新的免疫所偶聯(lián)物都必須開展廣泛的優(yōu)化，這是一個(gè)非 常耗時(shí)費(fèi)力且成本高昂的過程。此外，反應(yīng)性化學(xué)偶聯(lián)試劑本身，傾向于在化學(xué)上不穩(wěn)定， 易于水解，因此，需要在氬或氮?dú)舛栊苑諊匈A存，在重復(fù)使用時(shí)會(huì)導(dǎo)致結(jié)合重現(xiàn)性差的問 題。
[0009] 光學(xué)成像是PET的很有價(jià)值的補(bǔ)充手段，特別是作為腫瘤切除術(shù)的視覺輔助手 段。對(duì)體內(nèi)應(yīng)用來說，在近紅外（NIR，700-900nm)區(qū)成像最佳，因?yàn)樵诖藚^(qū)域所有生物分子 的吸收光譜都達(dá)到最低，為小型動(dòng)物研究及各種人類臨床情況（例如，乳腺成像、內(nèi)窺鏡檢 查、手術(shù)指導(dǎo)等）提供了一個(gè)清楚的光學(xué)窗口。在NIR窗口中，除組織光穿透更好以外，組 織自體熒光也顯著減少。雙重標(biāo)記成像在其中尤其有用的一個(gè)有價(jià)值的臨床應(yīng)用是通過首 先使用全身PET成像來確定腫瘤的位置，然后，采用近紅外光（NIRF)成像來引導(dǎo)腫瘤切除 術(shù)。此外，采用各波長全光譜的熒光染料可用于對(duì)組織表面上的腫瘤成像，例如，對(duì)胃腸系 統(tǒng)中、皮膚上或眼睛中的腫瘤成像。
[0010] 與光學(xué)成像探針的標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)存在同樣的非位點(diǎn)選擇性和重現(xiàn)性差的缺點(diǎn)，尤其是 從抗體至抗體。此外，利用光學(xué)成像探針和放射性標(biāo)記探針的雙偶聯(lián)方法涉及到各輪抗體 偶聯(lián)反應(yīng)的并聯(lián)或串聯(lián)，讓這些問題更加棘手。例如，確定螯合物與NIR染料的偶聯(lián)的正確 平衡，要求進(jìn)行幾輪優(yōu)化，以確定每個(gè)檢測探針的最佳標(biāo)記度，同時(shí)，保持抗體結(jié)合親和力， 對(duì)于每種新的免疫偶聯(lián)物來說，這是一個(gè)需要重復(fù)的過程。因此，當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)技術(shù)時(shí)， 由于保持抗原結(jié)合親和力的要求，無法總是達(dá)到最佳標(biāo)記度。
[0011] 為了解決這些問題，人們?cè)诮⒖贵w的位點(diǎn)特異性放射性標(biāo)記方法方面做出了種 種努力。除少數(shù)例外以外，這些策略都依賴經(jīng)特別設(shè)計(jì)而攜帶反應(yīng)性硫醇單元或融合蛋白 的抗體；但是，使用基因工程抗體增加了過多的復(fù)雜性及費(fèi)用，阻礙了系統(tǒng)臨床轉(zhuǎn)化的模塊 性和潛力。因此，需要一種穩(wěn)健可靠的、不需要特殊抗體工程的糖蛋白和抗體的位點(diǎn)選擇性 放射性標(biāo)記方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明提供了一種用于糖蛋白位點(diǎn)特異性標(biāo)記的方法、組合物和試劑盒，包括酶 介導(dǎo)摻入含化學(xué)手柄的經(jīng)過修飾的糖和標(biāo)記分子的環(huán)加成反應(yīng)化學(xué)的組合，標(biāo)記分子包 含：金屬離子螯合劑基團(tuán)及與經(jīng)過修飾的糖的化學(xué)手柄相連的反應(yīng)性基團(tuán)；熒光團(tuán)及與經(jīng) 過修飾的糖的化學(xué)手柄相連的反應(yīng)性基團(tuán)；或金屬離子螯合劑、與經(jīng)過修飾的糖的化學(xué)手 柄相連的反應(yīng)性基團(tuán)及熒光團(tuán)。在某些實(shí)施例中，糖蛋白包括末端GIcNAc殘基。在某些實(shí) 施例中，糖蛋白是抗體或Fc融合蛋白。在某些實(shí)施例中，抗體是IgA、IgE、IgD、IgG、IgM或 IgY。在某些實(shí)施例中，抗體具有細(xì)胞相關(guān)抗原親和力。在某些實(shí)施例中，末端GlcNAc殘基 位于抗體的Fc區(qū)域。
[0013] 在某些實(shí)施例中，提供了標(biāo)記糖蛋白的方法，所述方法包括：
[0014] a)提供一種包含末端GlcNAc殘基的糖蛋白；
[0015] b)提供一種包含化學(xué)手柄的經(jīng)過修飾的糖；
[0016] c)使糖蛋白與經(jīng)過修飾的糖接觸，其中所述的經(jīng)過修飾的糖與末端GlcNAc殘基 連接，提供修飾糖蛋白；
[0017] d)提供包括金屬離子螯合劑基團(tuán)和反應(yīng)性基團(tuán)的標(biāo)記分子；
[0018] e)使修飾糖蛋白與標(biāo)記分子接觸，其中所述反應(yīng)性基團(tuán)與化學(xué)手柄連接，提供標(biāo) 記糖蛋白；
[0019] f)提供放射性金屬離子；及
[0020] g)使標(biāo)記糖蛋白與放射性金屬離子接觸，其中所述金屬離子與螯合劑基團(tuán)締合， 提供放射性標(biāo)記糖蛋白。
[0021] 在某些實(shí)施例中，所述標(biāo)記分子進(jìn)一步包括熒光團(tuán)。在某些實(shí)施例中，糖蛋白包括 抗體或？(：融合蛋白。在某些實(shí)施例中，抗體是1 §4、1§￡、1§0、1§6、1§11或1 §￥。在某些實(shí)施 例中，抗體具有細(xì)胞相關(guān)抗原親和力。
[0022] 在某些實(shí)施例中，在步驟（C)之前，所述方法進(jìn)一步包括以下步驟：提供包含帶 GlcNAc-GlcNAc鍵的低聚糖的糖蛋白；提供酶，以在GlcNAc-GlcNAc鍵處裂解低聚糖；使所 述糖蛋白與酶接觸，提供含末端GlcNAc殘基的糖蛋白。在某些實(shí)施例中，所述酶是糖類內(nèi) 切酶。
[0023] 在某些實(shí)施例中，在步驟（C)之前，所述方法進(jìn)一步包括以下步驟：提供包含帶 NeuAc-Gal-GlcNAc鍵的低聚糖的糖蛋白；提供酶，以在NeuAc-Gal-GlcNAc鍵處裂解低聚 糖；使所述糖蛋白與酶接觸，提供包含帶Gal-GlcNAc鍵的低聚糖的糖蛋白。在某些實(shí)施例 中，所述酶是唾液酸酶。在某些實(shí)施例中，所述包含帶Gal-GlcNAc鍵的低聚糖的糖蛋白進(jìn) 一步與第二種酶接觸，以在Gal-GlcNAc鍵處裂解所述低聚糖，得到包含帶末端GIcNAc殘基 的低聚糖的糖蛋白。在某些實(shí)施例中，所述第二種酶是(6-半乳糖苷酶。
[0024] 在某些實(shí)施例中，在步驟（c)之前，所述方法進(jìn)一步包括以下步驟：提供包含帶 Gal-GlcNAc鍵的低聚糖的糖蛋白；提供酶，以在Gal-GlcNAc鍵處裂解低聚糖；使所述糖蛋 白與酶接觸，提供包含帶末端GIcNAc殘基的低聚糖的糖蛋白。在某些實(shí)施例中，所述酶是 3 -半乳糖苷酶。
[0025] 在某些實(shí)施例中，所述的經(jīng)過修飾的糖通過半乳糖轉(zhuǎn)移酶連接到末端GIcNAc殘 基上。在某些實(shí)施例中，所述半乳糖轉(zhuǎn)移酶是突變的半乳糖轉(zhuǎn)移酶。在某些實(shí)施例中，所述 半乳糖轉(zhuǎn)移酶是Y289L突變的半乳糖轉(zhuǎn)移酶。
[0026] 在某些實(shí)施例中，提供了標(biāo)記糖蛋白的方法，所述方法包括：
[0027] a)提供一種包含末端GlcNAc殘基的糖蛋白；
[0028] b)提供一種包含化學(xué)手柄的經(jīng)過修飾的糖；
[0029] c)使糖蛋白與經(jīng)過修飾的糖接觸，其中所述的經(jīng)過修飾的糖與末端GlcNAc殘基 連接，提供修飾糖蛋白；
[0030] d)提供包括金屬離了螯合劑基團(tuán)、反應(yīng)性基團(tuán)和熒光團(tuán)的標(biāo)記分子；
[0031] e)使修飾糖蛋白與標(biāo)記分子接觸，其中所述反應(yīng)性基團(tuán)與化學(xué)手柄連接，提供標(biāo) 記糖蛋白；
[0032] f)提供放射性金屬離子；及
[0033] g)使標(biāo)記糖蛋白與放射性金屬離子接觸，其中所述金屬離子與螯合劑基團(tuán)締合， 提供放射性標(biāo)記糖蛋白。
[0034] 在某些實(shí)施例中，所述糖蛋白包括抗體或Fc融合蛋白。在某些實(shí)施例中，抗體是 IgA、IgE、IgD、IgG、IgM或IgY。在某些實(shí)施例中，抗體具有細(xì)胞相關(guān)抗原親和力。
[0035] 在某些實(shí)施例中，在步驟（c)之前，所述方法進(jìn)一步包括以下步驟：提供包含帶 GlcNAc-GlcNAc鍵的低聚糖的糖蛋白；提供酶，以在GlcNAc-GlcNAc鍵處裂解低聚糖；使所 述糖蛋白與酶接觸，提供含末端GlcNAc殘基的糖蛋白。在某些實(shí)施例中，所述酶是糖類內(nèi) 切酶。
[0036] 在某些實(shí)施例中，在步驟（C)之前，所述方法進(jìn)一步包括以下步驟：提供包含帶 NeuAc-Gal-GlcNAc鍵的低聚糖的糖蛋白；提供酶，以在NeuAc-Gal-GlcNAc鍵處裂解低聚 糖；使所述糖蛋白與酶接觸，提供包含帶Gal-GlcNAc鍵的低聚糖的糖蛋白。在某些實(shí)施例 中，所述酶是唾液酸酶。在某些實(shí)施例中，所述包含帶Gal-GlcNAc鍵的低聚糖的糖蛋白進(jìn) 一步與第二種酶接觸，以在