一種氧連接氮乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)修飾糖蛋白質(zhì)及糖肽的化學(xué)衍生方法
【專利說(shuō)明】一種氧連接氮乙酰葡糖胺(O-GI cNAc)修飾糖蛋白質(zhì)及糖肽的化學(xué)衍生方法
[0001]本發(fā)明涉及氧連接氮乙酰葡糖胺(Ο-GlcNAc)修飾糖蛋白質(zhì)及糖肽的化學(xué)衍生。具體地說(shuō)是利用高碘酸鈉氧化修飾的氮乙酰葡糖胺形成醛基,利用吉拉德試劑上的酰阱基團(tuán)使該類糖蛋白質(zhì)及糖肽衍生上季銨鹽基團(tuán)。
【背景技術(shù)】
[0002]氧連接氮乙酰葡糖胺修飾是一種發(fā)生在蛋白質(zhì)絲氨酸及蘇氨酸殘基上的翻譯后修飾,是一種真核細(xì)胞內(nèi)重要的單糖翻譯后修飾,在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路中扮演重要作用。然而,該種翻譯后修飾的糖蛋白糖蛋白質(zhì)的研究與其他糖蛋白質(zhì)研究面臨相同的難點(diǎn):豐度低、糖肽占總肽段比例小,易被高豐度的非糖肽掩蓋,質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)低等。另外作為單糖修飾它也具有其獨(dú)有的研究難點(diǎn):修飾基團(tuán)小,對(duì)整體修飾糖蛋白或糖肽的理化性質(zhì)影響小,無(wú)法使用其他糖蛋白的富集手段以降低非修飾蛋白質(zhì)的干擾。
[0003]文獻(xiàn)報(bào)道中對(duì)該種糖蛋白質(zhì)常用的研究方法主要有酶促衍生富集法和凝集素親和法。另外最近有文獻(xiàn)(Journal of Proteome Research 2010,9,2200 - 2206)報(bào)道了一種利用高碘酸鈉氧化氮乙酰葡糖胺形成醛基,利用酰阱凝膠富集研究該種糖蛋白的工作,該工作開發(fā)了利用化學(xué)手段研究氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質(zhì)的手段,相較昂貴的酶促衍生手段,為廉價(jià)大規(guī)模研究氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質(zhì)提供可能。
[0004]在蛋白質(zhì)或肽段上衍生上季銨鹽基團(tuán)在增強(qiáng)樣品質(zhì)譜信號(hào),改變樣品電荷等方面有著廣泛的應(yīng)用。因此,鑒于氧連接氮乙酰葡糖胺的修飾會(huì)抑制蛋白及肽的質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào),我們通過(guò)季銨鹽基團(tuán)的修飾能有效地提高質(zhì)譜信號(hào),為后續(xù)的質(zhì)譜分析研究提供幫助。同時(shí)由于非修飾蛋白及肽段的干擾,季銨鹽基團(tuán)的加入改變了該種糖蛋白質(zhì)及肽段的電荷性質(zhì)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]衍生上季銨鹽基團(tuán)能夠增強(qiáng)樣品質(zhì)譜信號(hào),改變樣品電荷。本發(fā)明的目的是提供一種氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質(zhì)及糖肽的化學(xué)衍生上季銨鹽基團(tuán),從而提高該糖蛋白質(zhì)及糖肽質(zhì)譜信號(hào),改善其離子交換色譜分離能力。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0007]以高碘酸鈉作氧化劑,對(duì)修飾的氮乙酰葡糖胺基團(tuán)上的鄰位羥基進(jìn)行開環(huán)反應(yīng)形成兩個(gè)醛基基團(tuán),利用吉拉德試劑上的酰阱和新生成的醛基反應(yīng),從而糖蛋白質(zhì)及糖肽化學(xué)衍生上季銨鹽基團(tuán)。
[0008]所述氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質(zhì)及糖肽的化學(xué)衍生方法,具體步驟如下:
[0009](I)氮乙酰葡糖胺基團(tuán)氧化:在pH=5_6的30_100mM乙酸鈉緩沖溶液中,氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質(zhì)或糖肽樣品與濃度為20-30mM高碘酸鈉溶液反應(yīng);反應(yīng)溫度35-40°C,反應(yīng)時(shí)間4-8小時(shí)。氧化反應(yīng)結(jié)束后,加入4-6倍于高碘酸鈉摩爾量亞硫酸鈉,反應(yīng)10-40分鐘,終止氧化反應(yīng)。對(duì)于糖肽而言,采用甲醛二甲基化方法封閉N末端氨基,每100 μ g肽段加入1-4%甲醛溶液10-25 μ 1,0.15-0.6mM氰基硼氫化鈉10-25 μ I,反應(yīng)0.5-2
小時(shí),反相除鹽去除甲醛和氰基硼氫化鈉。
[0010](2)吉拉德試劑衍生反應(yīng):將經(jīng)過(guò)高碘酸鈉氧化的糖蛋白質(zhì)樣品于濃度為1-1OOmM的吉拉德試劑混合,反應(yīng)1-6小時(shí)。反應(yīng)過(guò)程在ρΗ=5_6的30_100mM乙酸鈉溶液中進(jìn)行。
[0011](3)采用反相液相色譜分離除去未反應(yīng)吉拉德試劑:采用反相C18或C8色譜住,流動(dòng)相A:2%乙腈,98%水及0.1%三氟乙酸。流動(dòng)相B:98%乙腈,2%水及0.1%三氟乙酸。采用2%流動(dòng)相B上樣,之后用上樣緩沖液沖洗色譜柱5-15分鐘,之后用80%流動(dòng)相將糖蛋白質(zhì)或糖肽樣品洗脫下來(lái),冷凍干燥。
[0012]衍生后的樣品用于后續(xù)色譜分析及質(zhì)譜分析。
[0013]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0014]1.本發(fā)明在氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質(zhì)及糖肽上衍生季銨鹽基團(tuán),增強(qiáng)樣品質(zhì)譜信號(hào),改善分離能力。
[0015]2.本發(fā)明采用酰肼和醛基的反應(yīng),反應(yīng)效率高,副反應(yīng)少。
[0016]3.本發(fā)明衍生的氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質(zhì)及糖肽,保留了部分原氮乙酰葡糖胺的基團(tuán),為后續(xù)質(zhì)譜解譜分析提供信息。
[0017]4.本發(fā)明利用化學(xué)方法衍生的氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質(zhì)及糖肽,更加廉價(jià),有利于大量大規(guī)模樣品分析。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質(zhì)及糖肽化學(xué)衍生流程圖
[0019]圖2氧連接氮乙酰葡糖胺修飾標(biāo)肽TAPTSgTIAPG衍生后MALDI質(zhì)譜
[0020]圖3標(biāo)肽TAPTSgTIAPG衍生前后質(zhì)譜信號(hào)增強(qiáng)幅度比較圖a) MALDI衍生肽段與未衍生肽段1:5混合。b)LTQ衍生肽段與未衍生肽段1:1混合
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的方法進(jìn)行詳述,但不以任何形式限制本發(fā)明。
[0022]實(shí)施例1
[0023]氧連接氮乙酰葡糖胺修飾標(biāo)準(zhǔn)糖肽衍生
[0024]如圖1所示,按如下流程制備:
[0025]I)標(biāo)準(zhǔn)糖肽N末端二甲基化封閉肽段TAPTSgTIAPG加入4%甲醛溶液
Iμ 1,0.6mM氰基硼氫化鈉I μ 1,反應(yīng)0.5小時(shí),反相除鹽去除甲醛和氰基硼氫化鈉。
[0026]2)氮乙酰葡糖胺基團(tuán)氧化:在ρΗ=5.5的50mM乙酸鈉緩沖溶液中,糖肽樣品與濃度為20mM高碘酸鈉溶液反應(yīng);反應(yīng)溫度37°C,反應(yīng)時(shí)間6小時(shí)。氧化反應(yīng)結(jié)束后,加入5倍于高碘酸鈉摩爾量亞硫酸鈉,反應(yīng)20分鐘,終止氧化反應(yīng)。
[0027]3)吉拉德試劑衍生反應(yīng):將經(jīng)過(guò)高碘酸鈉氧化的糖肽樣品于濃度為50mM的吉拉德試劑混合,反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)過(guò)程在pH=5.5的50mM乙酸鈉溶液中進(jìn)行。采用反相液相色譜分離除去未反應(yīng)吉拉德試劑。
[0028]2.所衍生后的標(biāo)肽的MALDI質(zhì)譜圖如圖2所示
[0029]3.由分子量計(jì)算得知,一分子標(biāo)肽與一分子吉拉德試劑反應(yīng),沒有明顯的未反應(yīng)的標(biāo)肽峰。
[0030]實(shí)施例2
[0031]為考察季銨鹽修飾基團(tuán)對(duì)質(zhì)譜信號(hào)的影響,用上述標(biāo)肽考察了 MALDI及ESI兩種離子源質(zhì)譜的信號(hào)響應(yīng)情況。
[0032]1.MALDI質(zhì)譜響應(yīng)情況:將化學(xué)衍生后的標(biāo)肽段和二甲基化封閉的標(biāo)肽用1:5混合,采用MALDI質(zhì)譜分析,譜圖如圖3(a),衍生后肽段的質(zhì)譜信號(hào)是衍生前的兩倍。因此結(jié)合摩爾比,衍生后該標(biāo)肽的質(zhì)譜信號(hào)增強(qiáng)了約10倍。
[0033]2.ESI質(zhì)譜響應(yīng)情況:將化學(xué)衍生后的標(biāo)肽段和二甲基化封閉的標(biāo)肽用1:1混合,采用RP-ES1-LTQ分析,譜圖如圖3(b),衍生后肽段的質(zhì)譜峰面積是衍生前的約2.2倍。
[0034]以上結(jié)果顯示,該化學(xué)衍生后氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質(zhì)和糖肽的質(zhì)譜響應(yīng)能得到增強(qiáng),獲得更好的質(zhì)譜鑒定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質(zhì)的衍生方法,其特征在于:該衍生方法是以高碘酸鈉作氧化劑,對(duì)修飾的氮乙酰葡糖胺基團(tuán)上的鄰位羥基進(jìn)行開環(huán)反應(yīng)形成兩個(gè)醛基基團(tuán),利用吉拉德試劑上的酰阱和新生成的醛基反應(yīng),從而將糖蛋白質(zhì)化學(xué)衍生上季銨鹽基團(tuán)。
2.一種氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖肽的衍生方法,其特征在于:該衍生方法是以高碘酸鈉作氧化劑,對(duì)修飾的氮乙酰葡糖胺基團(tuán)上的鄰位羥基進(jìn)行開環(huán)反應(yīng)形成兩個(gè)醛基基團(tuán),利用吉拉德試劑上的酰阱和新生成的醛基反應(yīng),從而將糖肽化學(xué)衍生上季銨鹽基團(tuán)。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的衍生方法,其特征在于:與氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質(zhì)及糖肽反應(yīng)的高碘酸鈉溶液濃度為20-30mM ;反應(yīng)溫度35-40°C,反應(yīng)時(shí)間4_8小時(shí),氧化反應(yīng)結(jié)束后,加入4-6倍于高碘酸鈉摩爾量亞硫酸鈉,反應(yīng)10-40分鐘,終止氧化反應(yīng)。整個(gè)過(guò)程在pH=5-6的30-100mM乙酸鈉溶液中進(jìn)行。
4.按照權(quán)利要求2所述的衍生方法,其特征在于:為避免糖肽N末端是絲氨酸或蘇氨酸殘基引發(fā)副反應(yīng),采用甲醛二甲基化方法封閉N末端氨基,每100 μ g肽段加入1-4%甲醛溶液10-25μ 1,0.15-0.6mM氰基硼氫化鈉10-25 μ 1,反應(yīng)0.5_2小時(shí),反相除鹽去除甲醛和氰基硼氫化鈉。
5.按照權(quán)利要求1所述的衍生方法,其特征在于:將經(jīng)過(guò)高碘酸鈉氧化的糖蛋白質(zhì)樣品與濃度為1-1OOmM的吉拉德試劑混合,反應(yīng)1-6小時(shí),反應(yīng)過(guò)程在ρΗ=5_6的50mM乙酸鈉溶液中進(jìn)行,采用反相液相色譜分離除去未反應(yīng)的吉拉德試劑。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種氧連接氮乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)修飾糖蛋白質(zhì)及糖肽的衍生方法,用于質(zhì)譜信號(hào)的增強(qiáng),以利于后續(xù)糖蛋白質(zhì)及糖肽的質(zhì)譜分析鑒定。所述的O-GlcNAc修飾糖蛋白質(zhì)和糖肽的衍生方法是以高碘酸鈉作氧化劑,對(duì)修飾的氮乙酰葡糖胺基團(tuán)上的鄰位羥基進(jìn)行開環(huán)反應(yīng)形成兩個(gè)醛基基團(tuán),利用吉拉德試劑(Girard Reagent)上的酰阱和新生成的醛基反應(yīng),從而完成O-GlcNAc修飾糖蛋白質(zhì)及糖肽的化學(xué)衍生。衍生后的糖蛋白質(zhì)及糖肽在保留一定原糖修飾基團(tuán),有利于后續(xù)質(zhì)譜等分析手段對(duì)該種糖基修飾的鑒別。
【IPC分類】G01N1-28
【公開號(hào)】CN104713754
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310691220
【發(fā)明人】張麗華, 夏思敏, 楊開廣, 張玉奎
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
【公開日】2015年6月17日
【申請(qǐng)日】2013年12月13日