一種檢測奶制品中β-內(nèi)酰胺酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測奶制品中0-內(nèi)酰胺酶的方 法，尤其涉及一種基于熒光底物探針的熒光值定量檢測奶制品中0-內(nèi)酰胺酶的方法
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，青霉素和頭孢菌素作為內(nèi)酰胺類藥物是治療牛乳腺炎的首選，是牛奶 中最常見的殘留抗生素，而乳品中殘留的抗生素危害食品安全和人體健康。我國無公害生 鮮牛乳的產(chǎn)品標(biāo)準中明文規(guī)定，生鮮牛乳中氨芐青霉素< 10yg/kg，青霉素不得檢出。因 此，國內(nèi)多數(shù)乳品企業(yè)對抗生素殘留超標(biāo)的牛乳采取降價收購原則，出于經(jīng)濟利益的驅(qū)動， 一些不法奶站為了謀求自己的經(jīng)濟利益，人為地使用一些生物制劑達到降解牛乳中殘留的 抗生素的目的，生產(chǎn)人造"無抗奶"。有研宄表明，牛奶中的抗生素分解劑是革蘭氏陽性菌產(chǎn) 生的內(nèi)酰胺酶，是人為添加的，而不是內(nèi)源性內(nèi)酰胺酶。內(nèi)酰胺酶可以分解牛 乳中的抗生素殘留使其降到允許量。但是目前為止，尚未有關(guān)于內(nèi)酰胺酶本身及其分 解產(chǎn)物對人體是否健康的安全性評價標(biāo)準，所以，國際食品法典委員會、歐盟、美國都不允 許0 -內(nèi)酰胺酶在食品中使用，我國《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準》（GB-2760)的食品用酶制 劑名單中也不包括內(nèi)酰胺酶。因此，內(nèi)酰胺酶是非法的食品添加劑，目前國際和國 內(nèi)均不允許該酶在牛奶中作為添加劑使用。
[0003] 因此，確立針對這種人造"無抗奶"的違規(guī)情況，相應(yīng)的檢測方法具有十分重要的 意義。目前比較成熟的檢測方法主要包括高效液相色譜法、碘量法、微生物法、頭孢菌素顯 色法、酸量法和免疫學(xué)方法。
[0004] (1)微生物法可以定性和定量地檢測牛奶中的內(nèi)酰胺酶。該方法可以檢測出 牛奶中未反應(yīng)完全（未失活）的內(nèi)酰胺酶，可用于檢測未經(jīng)過任何加工的牛奶，檢出限 較低。但也存在檢測種類有限、實驗周期長、只能給出定性結(jié)論等局限性。不適用于快速、 大規(guī)模的樣品檢測，但是，微生物法仍然是實驗室檢測牛奶中內(nèi)酰胺酶的主要方法。
[0005] (2)碘量法作為快速篩選方法，該法方便快捷、操作簡單、試劑易得，檢測革蘭陽 性細菌胞外酶陽性率高，為實驗室所普遍使用。該方法可檢出牛奶中已反應(yīng)及未反應(yīng)的 0-內(nèi)酰胺酶，可用于檢測鮮奶及奶制品中的內(nèi)酰胺酶，檢出限較高。但該方法對反應(yīng) 時間等條件要求較嚴格，有假陽性和假陰性現(xiàn)象，每次試驗均需要設(shè)置陽性和陰性對照，而 且靈敏度較差，重現(xiàn)性差。碘量法雖然經(jīng)典、快速，但其試劑配制較復(fù)雜，淀粉試劑易失效， 必須現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0006] (3)酸量法簡單易行，重復(fù)性好，最易獲取結(jié)果，且較靈敏，結(jié)果穩(wěn)定性好，假陽性 和假陰性結(jié)果較少，適用于大多數(shù)實驗室，雖然快速檢測，但檢測靈敏度偏低，且不能用于 酶動力學(xué)分析。
[0007] (4)高效液相色譜法具有檢測時間短、可以定量分析等優(yōu)點，但是存在靈敏度低、 檢測成本高、前處理操作復(fù)雜等缺點。
[0008] (5)頭孢菌素顯色法：該方法比較方便快捷，操作簡單，但是所用試劑價格昂貴， 定量檢測不準確。
[0009] (6)免疫分析法可通過特異性抗體的制備，直接識別目標(biāo)分子本身，特異性強，靈 敏度高，成本低，不需要大型復(fù)雜的設(shè)備即可進行，但是傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫方法需要多步洗 滌，比較耗時耗力，因此其使用也受到一定的限制。
[0010] CN101710122A公開了一種快速免疫檢測牛奶中0-內(nèi)酰胺酶的方法，該方法利 用包被與酶標(biāo)板上的鼠抗0-內(nèi)酰胺酶單克隆抗體，與兔抗0-內(nèi)酰胺酶多克隆抗體和 辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體組成三抗體夾心法試劑，進行三抗體夾心法免疫學(xué)檢測。 CN103134937A公開了一種檢測牛奶中0 -內(nèi)酰胺酶的雙抗體夾心法，該方法通過政策的免 疫、細胞融合、篩選后得到15株0 -內(nèi)酰胺酶單克隆抗體，并與辣根過氧化物酶進行兩兩配 對，以0 -內(nèi)酰胺酶為標(biāo)準品建立了 0 -內(nèi)酰胺酶的夾心ELISA分析方法。但這些方法都 需要制備抗體，多次洗滌，耗時耗力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測奶制品中0 _內(nèi)酰胺酶的方法，特別是一種基于 熒光底物探針的熒光值定量檢測奶制品中0-內(nèi)酰胺酶的方法。該檢測方法具有靈敏度 高、特異性強、快速、簡便等優(yōu)點。
[0012] 為達此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0013] 本發(fā)明提供了一種檢測奶制品中0 _內(nèi)酰胺酶的方法，該方法以熒光素-0 _內(nèi)酰 胺類抗生素作為熒光底物探針進行酶促反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)得到的熒光強度計算內(nèi)酰胺酶 的含量。
[0014] 本發(fā)明中的熒光底物探針可以被0-內(nèi)酰胺酶特異性地催化，其內(nèi)酰胺鍵斷裂， 然后變成兩個分子，其中一個為熒光素的基本結(jié)構(gòu)單元，其熒光得到很大程度地增強，而該 熒光強度和樣品中的內(nèi)酰胺酶的含量成正比，因此可以快速、特異性地檢測內(nèi)酰胺 酶的含量。
[0015] 本發(fā)明中，所述熒光底物探針的濃度為0.1-lyM，例如可以是0.lyM、0. 2yM、 0? 3yM、0. 4yM、0. 5yM、0. 6yM、0. 7yM、0. 8yM、0. 9yM或 1yM，優(yōu)選為 0? 4yM。
[0016] 優(yōu)選地，所述熒光底物探針對-內(nèi)酰胺酶具有廣譜性。
[0017] 本發(fā)明中，所述熒光底物探針由熒光素和0-內(nèi)酰胺類抗生素通過有機合成的方 式合成。本發(fā)明的熒光底物探針被0-內(nèi)酰胺酶特異性催化的反應(yīng)過程如下：
[0018]
【主權(quán)項】
1. 一種檢測奶制品中0-內(nèi)酰胺酶的方法，其特征在于，所述方法以熒光素-0-內(nèi)酰 胺類抗生素作為熒光底物探針進行酶促反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)得到的熒光強度計算內(nèi)酰胺酶 的含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述熒光底物探針的濃度為0. 1-1yM，優(yōu) 選為0? 4yM; 優(yōu)選地，所述熒光底物探針對內(nèi)酰胺酶具有廣譜性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述熒光底物探針由熒光素和0 -內(nèi) 酰胺類抗生素通過有機合成的方式合成； 優(yōu)選地，所述內(nèi)酰胺類抗生素為青霉素、頭孢菌素、頭霉素或硫霉素中的任意一 種，優(yōu)選為青霉素或頭孢菌素。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，所述酶促反應(yīng)時間為5-60min， 優(yōu)選為l〇_30min，進一步優(yōu)選為15min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于，所述方法包括在酶促反應(yīng)前，進 行內(nèi)酰胺酶的富集； 優(yōu)選地，所述富集為利用免疫磁珠進行富集。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： (1) 將免疫磁珠表面偶聯(lián)上0 _內(nèi)酰胺酶抗體，得到特異性識別0 _內(nèi)酰胺酶的免疫磁 珠探針； (2) 將步驟（1)得到的免疫磁珠探針置于待測分析液中，形成抗原-抗體免疫磁珠復(fù)合 物； (3) 將步驟（2)得到的復(fù)合物進行磁分離，從而實現(xiàn)內(nèi)酰胺酶的富集，得到免疫磁 珠-0-內(nèi)酰胺酶復(fù)合物； (4) 向步驟（3)得到的免疫磁珠-0 -內(nèi)酰胺酶復(fù)合物中加入熒光底物探針進行酶促反 應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)得到的熒光強度計算內(nèi)酰胺酶的含量。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（1)所述免疫磁珠為超順納米磁珠； 優(yōu)選為粒徑在200-2000nm的超順納米磁珠； 優(yōu)選地，所述免疫磁珠為具有60-100emu/g的比飽和磁化強度的免疫磁珠； 優(yōu)選地，所述偶聯(lián)為共價偶聯(lián)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： (1) 采用比飽和磁化強度為60-100emu/g，粒徑在200-2000的超順納米磁珠，通過共價 偶聯(lián)的方式將識別內(nèi)酰胺酶的抗體偶聯(lián)在超順納米磁珠的表面，制備成超順納米免疫 磁珠，得到特異性識別內(nèi)酰胺酶的免疫磁珠探針； (2) 將步驟（1)得到的免疫磁珠探針置于待測分析液中，形成抗原-抗體免疫磁珠復(fù)合 物； (3) 將步驟（2)得到的復(fù)合物在室溫下渦流震蕩反應(yīng)20min，然后進行磁分離，從而實 現(xiàn)0 -內(nèi)酰胺酶的富集，得到免疫磁珠-0 -內(nèi)酰胺酶復(fù)合物； (4) 向步驟（3)得到的免疫磁珠-0-內(nèi)酰胺酶復(fù)合物中加入0. 1-1yM的熒光 素_內(nèi)酰胺類抗生素作為熒光底物探針進行酶促反應(yīng)5-60min，根據(jù)反應(yīng)得到的熒光強 度計算0-內(nèi)酰胺酶的含量。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測奶制品中β-內(nèi)酰胺酶的方法。所述方法設(shè)計了一個能被β-內(nèi)酰胺酶特異性催化的熒光底物探針，該熒光底物探針的主要結(jié)構(gòu)是由熒光素的母環(huán)和β-內(nèi)酰胺類抗生素通過化學(xué)合成得到。β-內(nèi)酰胺酶可以催化熒光底物探針發(fā)出強烈的熒光，根據(jù)反應(yīng)得到的熒光強度計算β-內(nèi)酰胺酶的含量。通過本發(fā)明的方法能檢測到0.1ng/mL的β-內(nèi)酰胺酶，比傳統(tǒng)的ELISA方法靈敏度提高了兩個數(shù)量級，檢測時間縮短到45min，具有特異性強、靈敏度高、簡便、檢測快速等優(yōu)點，而且可以大大降低檢測費用。
【IPC分類】G01N21-64, G01N33-53
【公開號】CN104714006
【申請?zhí)枴緾N201510058885
【發(fā)明人】蔣興宇, 陳翊平, 吳景, 曹豐晶, 張曉青, 王卓, 牛亞靜
【申請人】國家納米科學(xué)中心
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2015年2月4日