檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物物理學分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種黃曲霉毒素(AFBi)檢測的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃曲霉毒素& (AFBJ是食品中存在的毒性最強的真菌毒素，屬于I類致癌物，對 人體危害極大。加強對它的檢測監(jiān)控對維護人類健康有著重要意義。目前快速篩查方法多 為基于免疫學檢測方法對其進行定性定量分析，如酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA)、免疫層析 柱測定法和基于不同標記物顯色的快速篩查試紙條等等。
[0003]突光共振能量轉(zhuǎn)移（FOrsterresonanceenergytransfer，簡稱FRET)，是指受激 發(fā)的能量供體將能量傳遞給基態(tài)受體的一個非輻射能量轉(zhuǎn)移過程，它對能量供受體之間的 距離及相對偶極方向的納米范圍內(nèi)變化非常敏感，只有在非常近的距離（10nm)以內(nèi)，才能 夠發(fā)生有效的能量共振轉(zhuǎn)移，且這種能量轉(zhuǎn)移效率與供受體之間距離成反比。因此FRET被 稱為一種高效的"光學分子尺"，近年來，該技術(shù)已經(jīng)在物理、化學及生物學領(lǐng)域得到了廣泛 的研究與應(yīng)用。量子點是一種隨粒徑大小變化可激發(fā)出不同波長熒光的納米晶體，隨粒徑 或最大發(fā)射波長的變化，量子點呈現(xiàn)出不同的顏色。如在最大發(fā)射波長530nm至550nm 范圍內(nèi)的量子點呈現(xiàn)綠色，而在最大發(fā)射波長590nm至620nm范圍內(nèi)的量子點呈現(xiàn)紅色。 量子點的優(yōu)點是熒光產(chǎn)率高，光穩(wěn)定性好，激發(fā)光譜廣而發(fā)射光譜窄，并且量子點表面可以 修飾任何所需的化學基團，能方便的標記在生物分子上，是作為FRET能量供受體的良好材 料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的創(chuàng)新性在于提出了一種新的快速、靈敏和廉價的免疫學定量檢測AFBi* 法，即基于紅、綠量子點間能量共振轉(zhuǎn)移信號來定量檢測痕量的AFBi。本發(fā)明基于兩種量子 點之間能量轉(zhuǎn)移的黃曲霉毒素&檢測方法，包括紅色量子點與AFBi偶聯(lián)物(試劑1)，綠色 量子點與抗AFBi單克隆抗體偶聯(lián)物(試劑2)和結(jié)合緩沖液(試劑3)。其中紅、綠量子點的 選擇前提是二者發(fā)射光譜沒有重疊，且綠色量子點的發(fā)射光譜在紅色量子點吸收光譜范圍 內(nèi)，具體為：綠色量子點最大發(fā)射波長介于530nm至550nm，表面氨基化修飾；紅色量子點 最大發(fā)射波長介于590nm至620nm，表面羧基化修飾。試劑1和試劑2在激發(fā)光下都有特 征發(fā)射波譜出現(xiàn)，當試劑1和試劑2以一定比例與試劑3混合孵育片刻后，由于抗原抗體結(jié) 合，兩種量子點靠近而產(chǎn)生能量共振轉(zhuǎn)移，綠色量子點的能量轉(zhuǎn)移給紅色量子點，使二者能 量一升一降，體現(xiàn)在發(fā)射光譜上就是綠色量子點特征發(fā)射光檢測值下降而紅色量子點特征 發(fā)射光檢測值提高，且升降幅度可以達到20%以上。在試劑1、試劑2和用試劑3倍比稀釋 的AFBi溶液混合孵育片刻后，由于游離的AFBi與試劑1共同競爭試劑2,導(dǎo)致部分試劑1與 試劑2不能結(jié)合而使綠色量子點能量回升，能量轉(zhuǎn)移效率下降。也就是說，AFBi的濃度直接 影響綠色量子點能量轉(zhuǎn)移效率，且在一定范圍二者成線性的反比例關(guān)系。以游離的AFBi& 度對數(shù)值為橫坐標，綠色量子點能量轉(zhuǎn)移效率為縱坐標，繪制出檢測AFBi濃度的標準曲線。 檢測食品樣品中AFBi含量時，試劑1、試劑2和待測食品樣品中AFBi提取溶液（以下簡稱待 測樣液)混合孵育片刻后，測定熒光強度，代入公式1 (參見實施例1)，按照計算出的能量轉(zhuǎn) 移效率，可以根據(jù)標準曲線計算出對應(yīng)的AFBi含量。
[0005] 本發(fā)明所述的一種基于兩種量子點之間能量轉(zhuǎn)移的黃曲霉毒素&檢測方法，技術(shù) 方案包含下列步驟： 一種基于兩種量子點之間能量轉(zhuǎn)移的黃曲霉毒素&檢測方法，包含以下步驟：（1)分 別制備綠色量子點與AFBi偶聯(lián)物、紅色量子點與抗AFBi的單克隆抗體偶聯(lián)物；（2)將綠色 量子點與AFBi偶聯(lián)物、紅色量子點與抗AFBi的單克隆抗體偶聯(lián)物混合，并與梯度濃度的 AFBi標準品溶液在結(jié)合緩沖液中共孵育，在波長450nm的激發(fā)光下測定綠色量子點能量轉(zhuǎn) 移效率；以AFBi標準品溶液濃度對數(shù)值為橫坐標，綠色量子點能量轉(zhuǎn)移效率為縱坐標，繪制 檢測AFBi的標準曲線；（3)將待測樣品提取液、綠色量子點與AFBi偶聯(lián)物、紅色量子點與抗 AFBi的單克隆抗體偶聯(lián)物在結(jié)合緩沖液中共孵育，測定綠色量子點能量轉(zhuǎn)移效率，與標準 曲線比對即得到待測樣品提取液中AFBi含量。
[0006] 所述綠色量子點和紅色量子點滿足：二者發(fā)射光譜要分的足夠開，即二者的發(fā)射 峰形不能有交疊，具體為：綠色量子點最大發(fā)射波長介于530nm至550nm，表面氨基化修 飾；紅色量子點最大發(fā)射波長介于590nm至620nm，表面羧基化修飾。
[0007] 所述步驟（1)中綠色量子點與AFBi偶聯(lián)，采用AFBi肟化產(chǎn)物在DCC，NHS介導(dǎo)下直 接與綠色量子點偶聯(lián)，葡萄糖酸封閉綠色量子點表面殘留的氨基位點；量子點與AFBi偶聯(lián) 摩爾比為1 :2~1 :20,優(yōu)選為1 :10。
[0008] 所述步驟（1)中紅色量子點與抗八?81單克隆抗體偶聯(lián)，采用EDC，NHSS介導(dǎo)將紅色 量子點與抗AFBi的單克隆抗體偶聯(lián)，氨基葡萄糖封閉紅色量子點表面殘留的羧基位點；量 子點與抗AFBi的單克隆抗體偶聯(lián)摩爾比為1 :1。
[0009] 步驟（2)綠色量子點與AFBi偶聯(lián)物、紅色量子點與抗AFBi的單克隆抗體偶聯(lián)物混 合摩爾比為1 :1~1 :6,優(yōu)選為1 :5。
[0010] 使用的EDC和NHSS的物質(zhì)量分別是量子點的100~500倍和50~100倍；活化 時間是20~40min;偶聯(lián)時將pH值調(diào)至7~8,偶聯(lián)時間是20~40min;封閉劑葡萄糖酸 或氨基葡萄糖封閉時間是〇. 5~1小時；封閉后調(diào)pH值至弱酸性為pH4. 5至5. 5 ;偶聯(lián) 產(chǎn)物用高速離心方法分離出來，離心條件是4°C~10°C，16000r/min~20000r/min，20~ 40min;復(fù)溶液為含有20%至30%丙三醇的0至0. 01mol/LpH7. 4磷酸鹽緩沖液。
[0011] 結(jié)合緩沖液為含10%甲醇的〇. 〇1M磷酸鹽緩沖液，溶液pH值為7. 4,結(jié)合溫度為 37°C,結(jié)合時間20分鐘。
[0012] 基于兩種量子點之間能量轉(zhuǎn)移的黃曲霉毒素檢測方法，具體包括如下步驟： (1)試劑1的制備：試劑1即綠色量子點與AFBi偶聯(lián)物。AFBi先用羧甲基羥胺半鹽酸 (CM0)肟化，即在AFBi結(jié)構(gòu)上增加一個羧基。再用N，N' -二環(huán)己基碳二亞胺（DCC)和N-羥 基琥珀酰亞胺（NHS)活化該羧基，加入與表面氨基修飾的綠色量子點進行偶聯(lián)，之后用葡萄 糖酸封閉，調(diào)pH值至弱酸性后離心純化，加入復(fù)溶液復(fù)溶。
[0013] (2)試劑2的制備：試劑2即紅色量子點與AFBi單克隆抗體偶聯(lián)物。將表面羧基 修飾的紅色量子點用水溶性碳二亞胺（EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉（NHSS)活化，與 AFBi單克隆抗體偶聯(lián)，之后用氨基葡萄糖封閉，調(diào)pH值至弱酸性，離心純化，加入復(fù)溶液復(fù) 溶。
[0014] (3)AFBi濃度標準曲線的制作：試劑1單獨與試劑3 (即結(jié)合溶液，含10%甲醇的 0. 01M磷酸鹽緩沖液，pH7. 4)混合，在激發(fā)光下測定綠色量子點特征發(fā)射熒光強度，得到數(shù) 據(jù)記為F。將試劑1、試劑2和用試劑3倍比稀釋的AFBi溶液共同混合孵育后，在激發(fā)光下 測定綠色量子點特征發(fā)射熒光強度，得到數(shù)據(jù)記為FN，其中N代表AFBi溶液的濃度。將（F- FN) /FX100%記錄為熒光能量轉(zhuǎn)移效率E(%)。以AFBi濃度對數(shù)為橫坐標，綠色量子點能 量轉(zhuǎn)移效率E(%)為縱坐標，繪制出檢測AFBi濃度的標