同時檢測烯草酮cle和氯酯磺草胺edp殘留的試紙條及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及蔬菜農(nóng)藥殘留免疫學(xué)快速檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種同時檢測烯 草酮CLE和氯酯磺草胺EDP殘留的試紙條及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 烯草酮CLE)和氯酯磺草胺EDP是新型旱田苗后除草劑，具有優(yōu)良的選擇性，適用 于大豆、油菜、棉花、花生等闊葉田防除野燕麥、馬唐、狗尾草、牛筋草、早熟禾、硬草等禾本 科雜草，施藥后能被禾本科雜草莖葉迅速吸收并傳導(dǎo)至莖尖及分生組織，抑制分生組織的 活性，破壞細(xì)胞分裂，最終導(dǎo)致雜草死亡。近年來，由于農(nóng)業(yè)病蟲害流行，烯草酮CLE和氯酯 磺草胺EDP作為除草劑，成為應(yīng)用范圍最多的藥物。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，由于不合理的使用劑量 和不遵守休藥期造成蔬菜中烯草酮和氯酯磺草胺殘留，其殘留對蔬菜可產(chǎn)生毒性作用。我 國和歐盟分別對烯草酮和氯酯磺草胺在組織中殘留也制定了最高殘留限量MRL。為了控制 烯草酮和氯酯磺草胺殘留，保障農(nóng)產(chǎn)品健康，有必要建立一種快速、有效的殘留檢測方法對 其殘留進行監(jiān)測。
[0003] 現(xiàn)有的烯草酮和氯酯磺草胺殘留檢測的方法主要為高效液相色譜HPLC分離，紫 外和質(zhì)譜檢測的儀器方法。雖然儀器方法在鑒定藥物種類和定量分析上表現(xiàn)出良好的性 能，但由于其操作復(fù)雜、分析費用昂貴，而不適用于對大量樣品進行殘留篩選。ELISA方法靈 敏度高、成本低，在藥物殘留檢測中應(yīng)用也很廣泛，但該方法需要酶標(biāo)儀等實驗室設(shè)備，分 析時間長，在應(yīng)用中有局限性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種同時檢測烯草酮CLE和氯酯磺草胺EDP殘留的試紙條 及其制備方法，以解決現(xiàn)有烯草酮和氯酯磺草胺在蔬菜殘留檢測時檢測費用高昂，不適用 于對大量樣品進行殘留篩選的問題。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為： 一種同時檢測烯草酮CLE和氯酯磺草胺EDP殘留的試紙條，試紙條為膠體金免疫層析 試紙條，它包括背板、吸水墊、硝酸纖維膜、結(jié)合墊、樣品墊，所述背板上依次連續(xù)粘附有吸 水墊、硝酸纖維膜、結(jié)合墊和樣品墊，所述樣品墊靠結(jié)合墊一端搭接在結(jié)合墊上，所述吸水 墊上表面吸附有手控區(qū)封膜，所述樣品墊上表面吸附有樣品端封膜，所述硝酸纖維膜上包 被有兔抗鼠的IgG質(zhì)控線和DCL-BSA兩條檢測線，結(jié)合墊上包被有抗CLE和EDP藥物單克 隆抗體-膠體金標(biāo)記物。
[0006] 同時檢測烯草酮CLE和氯酯磺草胺EDP殘留的試紙條的制備方法，它包括以下步 驟： 步驟一、將半抗原去環(huán)酯烯草酮DCL與牛血清白蛋白偶聯(lián)合成偶聯(lián)物DCL-BSA; 步驟二、將步驟一合成的所述偶聯(lián)物DCL-BSA免疫原免疫小鼠，通過細(xì)胞融合篩選得 到抗CLE和EDP藥物單克隆細(xì)胞株，分別將得到的抗CLE和EDP藥物單克隆細(xì)胞株注射到 小鼠腹腔，得到抗CLE和EDP藥物單克隆抗體，該抗體與烯草酮CLE和氯酯磺草胺EDP有 較高的交叉反應(yīng)； 步驟三、用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金； 步驟四、提取小鼠IgG免疫健康家兔，得到兔抗鼠IgG抗體； 步驟五、將步驟二制成的所述抗CLE和EDP藥物單克隆抗體加入步驟三制備的膠體 金中，得到抗CLE和EDP單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物； 步驟六、將步驟五制備的所述抗CLE和EDP單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物包被在所述結(jié) 合墊上； 步驟七、將步驟一合成的所述偶聯(lián)物DCL-BSA分別包被在所述硝酸纖維素膜中，得到 檢測線； 步驟八、將步驟四中制備的所述兔抗鼠IgG抗體包被在所述硝酸纖維素膜中，得到質(zhì) 控線； 步驟九、將所述手控區(qū)封膜、所述吸水墊、所述硝酸纖維素膜、所述結(jié)合墊、所述樣品墊 和所述樣品端封膜依次粘貼在所述背板上，制得同時檢測烯草酮CLE和氯酯磺草胺EDP殘 留的試紙條。
[0007] 膠體金免疫層析技術(shù)與目前普遍采用的標(biāo)記免疫分析技術(shù)相比，具有簡便快速， 特異性強、敏感性高，肉眼判斷，實驗結(jié)果易保存，無需特殊儀器設(shè)備等優(yōu)點，因此膠體金免 疫層析技術(shù)在藥物殘留檢測領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明中同時檢測烯草酮CLE和氯酯磺草胺EDP殘留的試紙條反應(yīng)原理為競爭 法：將樣品液滴加到試紙條樣品墊上，樣品在毛細(xì)管作用下沿試紙條泳動，當(dāng)泳動至金標(biāo)墊 時，固態(tài)化的金標(biāo)抗單抗迅速溶解釋放，隨樣品一起沿試紙條泳動至檢測線，若樣品中含有 CLE和EDP，藥物首先與金標(biāo)抗CLE和EDP單抗發(fā)生免疫反應(yīng)，形成免疫復(fù)合物，抑制金標(biāo)單 抗與檢測線包被的DCL-BSA偶聯(lián)物的結(jié)合，使檢測線截獲的金標(biāo)抗體的量減少，檢測線顏 色變淺，當(dāng)樣品中CLE、EDP的量足夠大時，檢測線將無顏色出現(xiàn)，金標(biāo)單抗穿過檢測線與被 包被于質(zhì)控線的兔抗鼠IgG截獲，質(zhì)控線出現(xiàn)紅色條帶；反之，若樣品中不含CLE和EDP，金 標(biāo)單抗與包被于NC膜上的DCL-BSA偶聯(lián)物發(fā)生特異性免疫反應(yīng)而被截獲，檢測線形成紅色 條帶，即陰性結(jié)果，部分金標(biāo)單抗穿過檢測線與被包被于質(zhì)控線的兔抗鼠IgG截獲，形成紅 色條帶。
[0009] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)篩選出抗CLE和EDP藥物的單克隆 抗體，通過膠體金的制備及膠體金標(biāo)記條件的探索研宄，在應(yīng)用抗CLE、EDP藥物單克隆抗 體和膠體金技術(shù)研宄建立抗CLE、EDP藥物單克隆抗體快速檢測試紙條，并對樣品性能進行 測定。試紙條檢測樣品范圍較寬，假陽性低，檢測靈敏、準(zhǔn)確、可靠，適用于蔬菜中EDP、CLE 藥物殘留的同時檢測。本發(fā)明制備放入試紙條性能穩(wěn)定，價格經(jīng)濟，適用于對大量樣品進行 快速殘留篩選。
【附圖說明】
[0010] 圖1是同時檢測烯草酮CLE和氯酯磺草胺EDP殘留的試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2是結(jié)果判定示意圖； 圖3是同時檢測烯草酮CLE和氯酯磺草胺EDP殘留的試紙條檢測不同濃度EDP、CLE標(biāo) 準(zhǔn)品結(jié)果圖； 圖4是同時檢測烯草酮CLE和氯酯磺草胺EDP殘留的試紙條標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖； 圖中：1、手控區(qū)封膜，2、背板，3、吸水墊，4、質(zhì)控線，5、硝酸纖維膜，6、檢測線，7、結(jié)合 墊，8、樣品墊，9、樣品端封膜。
【具體實施方式】
[0011] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明及本發(fā)明的使用效果作進一步詳細(xì)的描述。
[0012] 如圖1所示的一種同時檢測烯草酮CLE和氯酯磺草胺EDP殘留的試紙條，試紙條 為膠體金免疫層析試紙條，它包括背板2、吸水墊3、硝酸纖維膜4、結(jié)合墊7、樣品墊8,背板 2上依次連續(xù)粘附有吸水墊3、硝酸纖維膜4、結(jié)合墊7和樣品墊8,樣品墊8靠結(jié)合墊7 - 端搭接在結(jié)合墊7上，吸水墊3上表面吸附有手控區(qū)封膜1，樣品墊8上表面吸附有樣品端 封膜9,其特征在于：硝酸纖維膜4上包被有兔抗鼠的IgG質(zhì)控線5和DCL-BSA兩條檢測線 6,結(jié)合墊7上包被有抗CLE和EDP藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。
[0013] 一種同時檢測烯草酮CLE和氯酯磺草胺EDP殘留的試紙條的制備方法，它包括以 下步驟： 步驟一、將半抗原去環(huán)酯烯草酮DCL與牛血清白蛋白偶聯(lián)合成偶聯(lián)物DCL-BSA。
[0014] (1)稱取0-羧甲基輕胺半鹽酸鹽（AOAA) 21. 9mg、碳酸氫鈉8. 4mg溶解于三蒸水 4mL中，將上述液體逐滴加入到DCL溶液中（154mgDCL溶解于4mL甲醇中），室溫磁力攪拌 反應(yīng)3h。反應(yīng)后，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至含少量水，加入二氯甲烷4mL、無水乙醇2mL重新溶解，加 入無水硫酸鈉5g，振搖后靜置過夜。過濾后，60°C減壓旋轉(zhuǎn)。稱取上述蒸干物44. 2mg、N, N-二環(huán)已基碳二亞胺（DCC) 12. 4mg、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)6. 9mg溶解于DMF3mL中， 室溫下磁力攪拌反應(yīng)12h。將上述反應(yīng)液逐滴加入17mLBSA溶液中（110mgBSA溶解于 0.lmol/L磷酸鈉緩沖液（pH8. 0)中，邊加邊攪拌，置室溫下磁力攪拌反應(yīng)過夜。離心后取上 清，4°C生理鹽水中透析3d，每天更換透析液2次，即得偶聯(lián)物DE-BSA。
[0015] (2 )將上述偶聯(lián)物DE-BSA2000rpm離心5mim后，取上清液分裝，冷凍干燥 后，-20°C冰箱保存。在上述反應(yīng)中，將BSA換成OVA后，得到反應(yīng)偶聯(lián)物DCL-0VA，該偶聯(lián) 物作為ELISA檢測時作為包被原使用。
[0016] 步驟二、將步驟一合成的所述偶聯(lián)物DCL-BSA免疫原免疫小鼠，通過細(xì)胞融合篩 選得到抗CLE和EDP藥物單克隆細(xì)胞株，分別將得到的抗CLE和EDP藥物單克隆細(xì)胞株 注射到小鼠腹腔，得到抗CLE和EDP藥物單克隆抗體，該抗體與烯草酮CLE和氯酯磺草胺 EDP有較高的交叉反應(yīng)。
[0017] (1)動物免疫 用步驟一制備的免疫原（DCL-BSA)分別免疫6周齡雌性Balb/c小鼠，每只小鼠的免疫 劑量為l〇〇|ag/〇. 2mL。首次免疫，用無菌0. 01mol/L、pH7. 4PBS溶解免疫原，再與等量弗氏 完全佐劑混合，完全乳化，頸背部皮下分2-3點注射；加強免疫，用0.Olmol/L、pH7. 4PBS溶 解免疫原與等量弗氏不完全佐劑混合，充分乳化，小鼠腹腔注射。每次間隔14-21d，第3次 免疫后7-10d開始對免疫小鼠尾靜脈采血，收集血清，用ELISA檢測小鼠血清效價。末次 免疫后間隔4周以上，在細(xì)胞融合前3-4d，腹腔注射DCL-BSA抗原lOOl^g/O. 2mL/只，注射后 每天注意觀察，保證融合前小鼠狀態(tài)良好。
[0018] (2)CLE和EDP單克隆抗體制備 取1只用DCL-BSA免疫的Balb/c小鼠，從眼眶放血分離血清，處死。小鼠用75%酒 精浸泡5min，進行整體消毒。將小鼠四肢固定，然后用鑷子夾住小鼠下腹部皮膚，剪開一 小口，再用鑷子撕開皮膚，露出腹膜，在腹膜上用剪刀剪一小口；剪開腹膜，露出脾臟，用鑷 子夾住脾臟，用剪刀將脾臟外膜剪破，然后放入事先滅菌的勻漿器中；加適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基 (RPMI-1640)于勻漿器中，進行研磨，擠壓出脾細(xì)胞，取出勻漿器的勻漿棒，再補加適量基礎(chǔ) 培養(yǎng)基（RPMI-1640)，靜置2min，將上層細(xì)胞懸液吸取后，放入腹腔巨噬細(xì)胞離心管中，重 復(fù)上述操作1次。1200r/min離心10min，除去上清。將108個免疫脾細(xì)胞與1-2X10 7個 SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按照1: 10或1: 5的比例加入50mL離心管中，進行混勻，然后于1500r/ min水平離心10min，棄去上清。將離心管倒扣在滅菌的吸水紙上，把管中液體吸干。用手 指或桌面輕輕敲擊管底，讓沉淀的細(xì)胞松動，再把離心管置于37°C水浴鍋中。在1min內(nèi)緩 慢將50%PEG0. 8mL滴入離心管中，邊加邊輕輕用吸管尖攪拌沉淀細(xì)胞。再繼續(xù)攪拌30sec 后，靜置lmin，然后慢慢加入40mL1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基（事先進行37°C預(yù)溫）。加基礎(chǔ)培養(yǎng)基 方法為：第lmin內(nèi)逐滴滴入lmL，第2min內(nèi)加2mL，第3min內(nèi)加3mL，第4min內(nèi)加其余的 4mL，在每次加培養(yǎng)基時需緩慢加入，并輕輕地攪