黃曲霉毒素b1免疫反應(yīng)電極的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種免疫反應(yīng)電極的制備方法，具體地說(shuō)是一種黃曲霉毒素BI免疫反應(yīng)電極的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]黃曲霉毒素(Af latoxin，AF)是迄今發(fā)現(xiàn)的毒性最強(qiáng)的一類(lèi)生物毒素，具有誘導(dǎo)突變、抑制免疫和致癌作用。其中黃曲霉毒素B1 (AFB1)的致癌性、致突變性、致畸性均居首位。為此，許多國(guó)家對(duì)其在食品和飼料中的含量進(jìn)行了嚴(yán)格的限定，歐盟規(guī)定AFB1的最大檢出量不得超過(guò)2ng/g?？焖贉?zhǔn)確分析是避免和減小AF危害的有效手段。目前AFBl分析檢測(cè)方法主要有薄層層析法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫測(cè)定法、放射免疫測(cè)定法、金標(biāo)法，免疫親和柱凈化-熒光快速檢測(cè)技術(shù)等，雖然取得了較大進(jìn)展，但仍然存在操作要求高、步驟過(guò)于繁瑣、靈敏度較差、誤檢率高、儀器昂貴等不同缺陷。
[0003]電化學(xué)免疫傳感器基于抗原和抗體的識(shí)別與結(jié)合，具有很強(qiáng)的特異性，近年來(lái)的信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)使檢測(cè)靈敏度大大提高。其中，有標(biāo)記免疫傳感器需要對(duì)抗原或抗體進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記物的量變來(lái)監(jiān)控免疫分析反應(yīng)，該方法的性質(zhì)決定了其分析操作步驟繁雜，難以進(jìn)一步簡(jiǎn)化。無(wú)標(biāo)記型免疫傳感器能直接測(cè)定抗原抗體復(fù)合物形成時(shí)氧化還原化學(xué)反應(yīng)的變化，簡(jiǎn)化制備和操作過(guò)程，能有效地提高分析速度，降低分析成本，但也還存在一些問(wèn)題。Owino等將AFBjj^i^AFB ^Ab通過(guò)靜電吸附固定在以鉬電極為基體的聚苯乙稀磺酸-聚苯胺修飾電極上，采用交流阻抗法對(duì)AFB1進(jìn)行定量分析，其檢測(cè)極限僅為0.1mg/Lo該方法節(jié)省時(shí)間，穩(wěn)定性比較好，但由于抗體的吸附固定量少，特異性差，靈敏度低，難以滿足實(shí)際測(cè)定要求。還有人在以2-氨基乙硫醇修飾的二維金插指電極上自組裝一層納米金膠粒，將AFBj^體直接固定在金膠粒上，再將整個(gè)電極浸入辣根過(guò)氧化物酶溶液中，制成電導(dǎo)型AFB1傳感器，其檢測(cè)極限達(dá)到0.lug/Lo由于該電極上修飾了一層納米金，有效地提高了測(cè)量靈敏度。但是，由于納米金粒在電極上的分布和尺寸難以控制，而且自組裝金粒層的機(jī)械穩(wěn)定性差，直接影響到了測(cè)量結(jié)果的可重復(fù)性。
[0004]可見(jiàn)，提高AFBl免疫傳感器性能最有效的途徑是:改善基體電極的性能，)保證抗體在免疫電極上有效固定，構(gòu)建性能優(yōu)越的分子識(shí)別膜。
[0005]蛋白A ( staphylococcal protein A, SPA)是一種多肽，其分子具有5個(gè)能夠特異性結(jié)合抗體分子Fe片段的功能域，且親合力較強(qiáng)。通過(guò)SPA結(jié)合抗體，使抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)Fab段得到充分的暴露，并較好地保持其空間構(gòu)象，有助于提高固相抗體的特異性和利用率，提高傳感器的靈敏度，改善免疫檢測(cè)效果。目前SPA的固定方法有自組裝法、物理吸附法以及摻雜法等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種方法簡(jiǎn)單，抗體固定可靠、牢固，抗體的特異性和利用率大大提高，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，可實(shí)現(xiàn)快速測(cè)量的黃曲霉毒素BI免疫反應(yīng)電極的制備方法。
[0007]本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題采用的技術(shù)方案是:一種黃曲霉毒素BI免疫反應(yīng)電極的制備方法，其特征在于:其包括以下步驟:
(1)制備聚鄰苯二胺修飾金電極:將50mmol/L的鄰苯二胺，溶解于1.0 mol/L H2SO4,以金電極為工作電極，鉑電極為對(duì)電極，硫酸亞汞電極為參比電極，采用循環(huán)伏安法制備得到聚鄰苯二胺修飾金電極；
(2)戊二醛的固定:將上述修飾金電極插入到2.5%戊二醛的磷酸緩沖溶液中，恒溫25-30 °C，反應(yīng)時(shí)間為40-60min，將戊二醛固定在該修飾金電極表面；
(3)蛋白A的交聯(lián)固定:將步驟(2)得到的電極放入0.1 g/L的蛋白A溶液中，恒溫25-30 °C，反應(yīng)時(shí)間為50-60min，形成蛋白A/戊二醛/聚鄰苯二胺/金電極；
(4)抗體的固定:將步驟(3)得到的蛋白A/戊二醛/聚鄰苯二胺/金電極放入1.2 mg/mL的無(wú)標(biāo)記AFBl抗體溶液中，恒溫25-30 °C，反應(yīng)時(shí)間為50_60min，形成AFBl抗體/蛋白A/戊二醛/聚鄰苯二胺/金電極；
(5)封閉:將步驟(4)得到的電極浸入到3%小牛血清溶液中，恒溫25-30°C，時(shí)間為40-60min，得到AFBl免疫反應(yīng)電極。
[0008]本發(fā)明通過(guò)在電聚合聚鄰苯二胺修飾金電極基礎(chǔ)上有效固定戊二醛；再將蛋白A固定在戊二醛上，蛋白A的氨基與戊二醛的醛基之間發(fā)生能生成希夫堿的反應(yīng)，可以有效提高蛋白A在電極表面的固定量和牢固度，為有效固定抗體奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明固定的AFBI抗體，能夠在一定程度上維持其空間構(gòu)象，使Fab片段都有序地伸向表面外，有效降低抗體與抗原結(jié)合的空間阻力，提高抗體的特異性和利用率，提高免疫反應(yīng)電極的靈敏度。本發(fā)明制備的無(wú)標(biāo)記免疫反應(yīng)電極不需要對(duì)抗原或抗體進(jìn)行標(biāo)記，能直接測(cè)定抗原抗體復(fù)合物形成時(shí)氧化還原化學(xué)反應(yīng)的變化，簡(jiǎn)化制備和操作過(guò)程，有效地提高分析速度，降低了分析成本。
【具體實(shí)施方式】
[0009]下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步描述。
[0010]實(shí)施例1:一種黃曲霉毒素BI免疫反應(yīng)電極的制備方法，其包括以下步驟:
(I)制備聚鄰苯二胺修飾金電極:將50 mmol/L的鄰苯二胺，溶解于1.0 mol/L H2SO4,以直徑為3mm的金電極為工作電極，鉑電極為對(duì)電極，硫酸亞汞電極為參比電極，采用循環(huán)伏安法，電聚合電位范圍為-0.6 V-1.0 V，掃描速率為50 mV/s，聚合圈數(shù)為30圈，恒溫25°C，制備得到聚鄰苯二胺修飾金電極。
[0011](2)戊二醛的固定:將上述修飾金電極插入到2.5%戊二醛的磷酸緩沖溶液中，恒溫25 °C，反應(yīng)時(shí)間為60min。。聚鄰苯二胺的氨基與戊二醛的醛基發(fā)生生成希夫堿的反應(yīng)，將戊二醛固定在修飾金電極表面。
[0012](3)蛋白A的交聯(lián)固定:將步驟(2)得到的電極放入0.1 g/L的蛋白A溶液中，恒溫25 0C，反應(yīng)時(shí)間為60min，蛋白A的氨基與戊二醛的另一個(gè)醛基發(fā)生生成希夫堿的反應(yīng)，保證一定量的蛋白A在電極表面的牢固固定，形成蛋白A/戊二醛/