-MS的提 取、分析和鑒定過程，但本發(fā)明的保護范圍不局限于該實驗，具體步驟如下：
[0034] 1、儀器與試藥
[0035] 安捷倫7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀配自動進樣器；發(fā)酵蟲草菌絲膠囊， 0· 2g*60 粒。
[0036] 2、發(fā)酵蟲草產(chǎn)品揮發(fā)性成分的提取
[0037] 分別精密稱取發(fā)酵蟲草產(chǎn)品約10g，置于500ml的圓底燒瓶中，加入250ml的去離 子水，另取50ml的無水乙醚作為萃取溶劑，置于250ml的圓底燒瓶中，兩個燒瓶裝在SDE 同時蒸餾萃取裝置上，置加熱套加熱使去離子水沸騰，以45°C油浴加熱萃取溶劑，連續(xù)萃取 12h，冷卻至室溫，將U型管和250ml圓底燒瓶里的乙醚層合并，加入NaCl粉末至過量，取出 乙醚層，加入過量的無水硫酸鈉粉末過夜干燥，濾出干燥劑，取出乙醚層，室溫下氮吹至干， 得到黃色透明油狀物，稱重。繼續(xù)復溶在1000 ul的無水乙醚中，4°C下保存，待測。
[0038] 3、氣相色譜-質(zhì)譜分析條件
[0039] 色譜柱：HP-5MS毛細管柱（30mX 0. 25cmX 0. 25mm);程序升溫條件：初始溫度 40°C，停留2min，以5°C /min的速度升至70°C，停留2min，以15°C /min的速度升至160°C， 停留5min，以2°C /min上的速度升至180°C，停留2min，以5°C /min的速度升至280°C，停 留2min;進樣方式：分流進樣，分流比100 : 1;載氣流速lml/min;進樣量：lyL;進樣口溫 度：250°C ;離子源溫度：230°C ;接口溫度280°C ;四級桿溫度150°C ;離子源電壓：70ev ;質(zhì) 譜掃描范圍：(m/z)35_480amu。
[0040] 4、方法學考察
[0041] (1)精密度試驗
[0042] 精密稱取1批發(fā)酵蟲草菌絲，按實施例1的方法提取揮發(fā)性成分提取物，按實施 例1的氣相色譜-質(zhì)譜條件分析，連續(xù)進樣5次。以GC-MS總離子流圖中以4號峰的保留 時間和峰面積為參照，分別計算10個特征峰（參見圖1)的相對保留時間和峰面積，結(jié)果顯 示各特征峰的相對保留時間的RSD在0. 2%以內(nèi)，相對峰面積的RSD在8. 1 %以內(nèi)，表明儀 器的精密度良好。
[0043] (2)重復性試驗
[0044] 按實施例1的方法平行制備同一批發(fā)酵蟲草菌絲揮發(fā)性成分提取物5份，按實施 例1的氣相色譜-質(zhì)譜條件分析，每份樣品進樣一次。以GC-MS總離子流圖中以4號峰的 保留時間和峰面積為參照，分別計算10個特征峰（參見圖1)的相對保留時間和峰面積，結(jié) 果顯示各特征峰的相對保留時間的RSD在0. 2%以內(nèi)，相對峰面積的RSD在7. 5%以內(nèi)，提 示方法的重復性良好。
[0045] (3)穩(wěn)定性試驗
[0046] 按實施例1的方法制備發(fā)酵蟲草菌絲揮發(fā)性成分提取物，分別于制備后0、4、8、 16、24h進樣測定。以GC-MS總離子流圖中以4號峰的保留時間和峰面積為參照，分別計算 10個特征峰（參見圖1)的相對保留時間和峰面積，結(jié)果顯示24h內(nèi)各特征峰的相對保留時 間的RSD在0. 3 %以內(nèi)，相對峰面積的RSD在8. 8 %以內(nèi)，結(jié)果表明溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良 好。
[0047] 5、數(shù)據(jù)處理和分析
[0048] 色譜圖的保留時間和積分面積由工作站自動完成，利用NISTll譜庫檢索鑒定色 譜峰。各揮發(fā)性成分的相對含量通過面積歸一化法得到。通過化學計量學軟件將色譜圖進 行多元化統(tǒng)計處理。
[0049] 表1發(fā)酵蟲草產(chǎn)品揮發(fā)性成分的鑒定表
[0050]
【主權(quán)項】
1. 一種基于GC-MS技術(shù)鑒別發(fā)酵蟲草菌絲品種的方法，包括如下步驟： (a) 供試品溶液的制備：精密稱取發(fā)酵蟲草菌絲5~20g，置于500ml的圓底燒瓶中，加 入100~250ml的去離子水，另取50ml的無水乙醚作為萃取溶劑，置于250ml的圓底燒瓶 中，兩個燒瓶裝在SDE同時蒸餾萃取裝置上，置加熱套加熱使去離子水沸騰，以45°C油浴加 熱萃取溶劑，連續(xù)提取4~24h，冷卻至室溫，將U型管和250ml圓底燒瓶里的乙醚層合并， 加入NaCl粉末至過量，取出乙醚層，加入過量的無水硫酸鈉粉末過夜干燥，濾出干燥劑，取 出乙醚層，室溫下氮吹至干，得到黃色透明油狀物，稱重；復溶在100~5000y1的無水乙醚 中，4°C下保存，作為供試品溶液； (b)GC-MS測定條件：色譜柱：HP-5MS毛細管柱；程序升溫條件：初始溫度40°C，停留 2min，以5°C/min的速度升至70°C，停留2min，以15°C/min的速度升至160°C，停留5min， 以2°C/min上的速度升至180°C，停留2min，以5°C/min的速度升至280°C，停留2min;進 樣方式：分流進樣，分流比100 : 1 ;載氣流速lml/min;進樣量：1yL;進樣口溫度：250°C; 離子源溫度：230°C;接口溫度280°C;四級桿溫度150°C;離子源電壓：70ev;質(zhì)譜掃描范圍： (m/z)35-480amu； (c)GC-MS色譜圖的測定：將上述步驟（a)得到的供試品溶液，注入GC-MS聯(lián)用儀，測 定，計算各峰的相對含量； (d) 發(fā)酵蟲草菌絲揮發(fā)性成分的鑒定：以NIST譜庫檢索，對發(fā)酵蟲草產(chǎn)品揮發(fā)性成分 進行鑒定； (e) 化學計量學分析：通過化學計量學軟件進行數(shù)據(jù)分析，直觀區(qū)分不同發(fā)酵蟲草產(chǎn) 品和偽品。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種基于GC-MS技術(shù)鑒別發(fā)酵蟲草菌絲品種的方法，其特征在 于，在所述的步驟（a)中，發(fā)酵蟲草菌絲揮發(fā)油的提取采用SDE同時蒸餾萃取法。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種基于GC-MS技術(shù)鑒別發(fā)酵蟲草菌絲品種的方法，其特征 在于，在所述的步驟（a)中，所述的發(fā)酵蟲草菌絲與去離子水的質(zhì)量體積比為I: 10~ 1 : 50,提取時間為4~24h。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種基于GC-MS技術(shù)鑒別發(fā)酵蟲草菌絲品種的方法，其特 征在于，在所述的步驟（b)中，GC-MS色譜分析的條件包括：色譜柱：HP-5MS毛細管柱 (30mX0. 25cmX0. 25mm);程序升溫條件：初始溫度40°C，停留2min，以5°C/min的速度升 至70°C，停留2min，以15°C/min的速度升至160°C，停留5min，以2°C/min上的速度升至 180°C，停留2min，以5°C/min的速度升至280°C，停留2min;進樣方式：分流進樣，分流比 100 : 1 ;載氣流速lml/min;進樣量：1yL;進樣口溫度：250°C;離子源溫度：230°C;接口溫 度280°C;四級桿溫度150°C;離子源電壓：70ev;質(zhì)譜掃描范圍：(m/z)35-480amu。
5. 如權(quán)利要求1所述的一種基于GC-MS技術(shù)鑒別發(fā)酵蟲草菌絲品種的方法，其特征在 于，在所述的步驟（c)中，所述的相對含量采用采用面積歸一化方法進行計算。
6. 如權(quán)利要求1所述的一種基于GC-MS技術(shù)鑒別發(fā)酵蟲草菌絲品種的方法，其特征在 于，在所述的步驟（d)中，所述的發(fā)酵蟲草菌絲揮發(fā)性成分的鑒定采用NIST譜庫檢索的方 法。
7. 如權(quán)利要求1所述的一種基于GC-MS技術(shù)鑒別發(fā)酵蟲草菌絲品種的方法，其特征在 于，在所述的步驟（e)中，所用的化學計量學軟件為SIMCAP+12.0軟件。
8.如權(quán)利要求1所述的一種基于GC-MS技術(shù)鑒別發(fā)酵蟲草菌絲品種的方法，其特征在 于對發(fā)酵蟲草產(chǎn)品中揮發(fā)性成分進行了詳細的鑒定，解決了對發(fā)酵蟲草菌絲品種的鑒別問 題。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種基于GC-MS技術(shù)鑒別發(fā)酵蟲草菌絲品種的方法，具體步驟包括：1)發(fā)酵蟲草菌絲中揮發(fā)性成分的提??；2)確定GC-MS分析發(fā)酵蟲草菌絲中揮發(fā)性成分的條件并對樣品進行測定；3)對揮發(fā)性化學成分進行定性分析；4)通過化學計量學手段進行GC-MS數(shù)據(jù)分析，鑒別發(fā)酵蟲草菌絲的品種。本發(fā)明的優(yōu)點在于選擇GC-MS技術(shù)對發(fā)酵蟲草菌絲中揮發(fā)性成分進行鑒定，解決了對發(fā)酵蟲草菌絲品種的鑒別問題；該方法操作簡便、實驗結(jié)果直觀可靠，為發(fā)酵蟲草菌絲產(chǎn)品的質(zhì)量控制和評價提供一種方法。
【IPC分類】G01N30-06, G01N30-88
【公開號】CN104730192
【申請?zhí)枴緾N201510114422
【發(fā)明人】胡坪, 李亞慧, 章弘揚, 張敏, 王月榮
【申請人】華東理工大學
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年3月16日