一種用于檢測(cè)心腦血管疾病酶活性的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體地說，涉及一種用于檢測(cè)心腦血管疾病酶活性的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]心腦血管疾病與惡性腫瘤、中老年感染性疾病，是威脅人類健康的三大殺手。心腦血管病的發(fā)生、發(fā)展與人們的日常生活密切相關(guān)，其發(fā)病率在我國有逐年增高的趨勢(shì)，近年來已經(jīng)成為危害人類健康的頭號(hào)殺手，具有“發(fā)病率高，死亡率高，致殘率高，復(fù)發(fā)率高”以及“并發(fā)癥多”的四高一多的特點(diǎn)。
[0003]心腦血管疾病已被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為危害人類健康的“頭號(hào)殺手”。全世界每年約有1500萬人死于心腦血管病，我國每年約有400萬人死于此病，占死亡人數(shù)的60%以上。全世界心腦血管病發(fā)病率最高的國家地區(qū)就在中國，中國以北方為高發(fā)病區(qū)。我國每小時(shí)就有300人死于心腦血管病，即每12秒I人。對(duì)心腦血管病的預(yù)防和治療刻不容緩。
[0004]治愈疾病最好的方法就是提早發(fā)現(xiàn)，防范于未然。尤其針對(duì)心腦血管病四高一多的特點(diǎn)，人們急需一種能早期檢測(cè)心腦血管病的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)心腦血管疾病酶活性的試劑盒，用于快速監(jiān)控和預(yù)測(cè)冠心病心肌梗塞和心腦血管血栓發(fā)病前血中Lp-PLA2酶的濃度。Lp-PLA2具有促炎癥和促動(dòng)脈粥樣硬化的作用。因此Lp-PLA2從炎癥細(xì)胞中產(chǎn)生和釋放也可以被解讀成為一個(gè)極佳的前炎癥反應(yīng)指標(biāo)，通過檢測(cè)循環(huán)系統(tǒng)中的Lp-PLA2酶水平，可以獨(dú)立的預(yù)測(cè)心腦血管的病發(fā)。病人血中Lp-PLA2酶的濃度突然升高，將強(qiáng)烈警示病人在短期內(nèi)可能發(fā)生心腦血管血栓的高度危險(xiǎn)性。心腦血管血栓也就是俗話說的腦血栓中風(fēng)，發(fā)病死亡率都極高。Lp-PLA2的檢測(cè)可以幫助病人在發(fā)病前警示發(fā)病的危險(xiǎn)性，從而進(jìn)行及時(shí)的預(yù)防或治療，有效降低發(fā)病造成的死亡率。
[0006]其技術(shù)方案如下:
[0007]一種用于檢測(cè)心腦血管疾病酶活性的試劑盒，其組成成分包括:酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液、樣品稀釋液、顯色液、酶標(biāo)記物、濃縮洗滌液、終止液和覆膜，
[0008]所述標(biāo)準(zhǔn)品:濃度為6，000pg/ml，3，000pg/ml，I, 500pg/ml，750pg/ml，375pg/ml，187.5pg/ml，93.75pg/ml，Opg/ml ；
[0009]所述樣品稀釋液為碳酸鹽緩沖液；
[0010]所述顯色液為四甲基苯胺；
[0011 ] 所述酶標(biāo)記物為堿性碳酸酶；
[0012]所述濃縮洗滌液為含吐溫20的10倍濃縮的磷酸緩沖鹽；
[0013]所述終止液:2MH2S04。
[0014]進(jìn)一步，所述酶標(biāo)板的材質(zhì)為聚苯乙烯PS。
[0015]進(jìn)一步，所述標(biāo)準(zhǔn)品臨用前15分鐘內(nèi)配制，以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒、搓動(dòng)以助溶解，如配制3，000pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品:取0.5ml (不要少于0.5ml) 6，000pg/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加進(jìn)含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果:
[0017]本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)過程簡(jiǎn)便，快捷，費(fèi)用低，準(zhǔn)確率高。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合實(shí)施方式進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0019]本發(fā)明的原理為:用純化的人脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(Lp-PL_A2)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(Lp-PL-A2)，再與HRP標(biāo)記的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2 (Lp-PL-A2)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(Lp-PL-A2)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(0D值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2 (Lp-PL-A2)含量。
[0020]樣本處理
[0021]血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
[0022]血漿:應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。
[0023]尿液:用無菌管收集，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。
[0024]細(xì)胞培養(yǎng)上清:檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS (PH7.2-7.4)稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
[0025]組織標(biāo)本:切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8°C的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4)，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。
[0026]標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于_20°C保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
[0027]操作步驟
[0028]步驟1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣:在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100 μ 1，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μ 1，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100 μ I分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μ 1，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50 μ I棄掉，再各取50 μ I分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50 μ I分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μ 1，混勻后從第七、第八孔中分別取50 μ I加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μ 1，混勻后從第九第十孔中各取50 μ I棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為50 μ 1，濃度分別為 18 μ g/L，12 μ g/L，6 μ g/L，3 μ g/L，1.5 μ g/L)。
[0029]步驟2.加樣:分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μ 1，然后再加待測(cè)樣品10 μ I (樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。
[0030]步驟3.溫育:用封板膜封板后置37°C溫育30分鐘。
[0031]步驟4.配液:將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。
[0032]步驟5.洗滌:小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
[0033]步驟6.加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑50 μ 1，空白孔除外。
[0034]步驟7.溫育:操作同步驟3。
[0035]步驟8.洗滌:操作同步驟5。
[0036]步驟9.顯色:每孔先加入顯色劑50 μ 1，輕輕震蕩混勻，37°C避光顯色15分鐘.
[0037]步驟10.終止:每孔加終止液50 μ I，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。
[0038]步驟11.測(cè)定:以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
[0039]以上所述，僅為本發(fā)明最佳實(shí)施方式，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見地得到的技術(shù)方案的簡(jiǎn)單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于檢測(cè)心腦血管疾病酶活性的試劑盒，其特征在于，其組成成分包括:酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液、樣品稀釋液、顯色液、酶標(biāo)記物、濃縮洗滌液、終止液和覆膜， 所述標(biāo)準(zhǔn)品:濃度為 6，OOOpg/ml，3，OOOpg/ml，1，500pg/ml，750pg/ml，375pg/ml，187.5pg/ml，93.75pg/ml，Opg/ml ； 所述樣品稀釋液為碳酸鹽緩沖液； 所述顯色液為四甲基苯胺； 所述酶標(biāo)記物為堿性碳酸酶； 所述濃縮洗滌液為含吐溫20的10倍濃縮的磷酸緩沖鹽； 所述終止液:2MH2S04。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測(cè)心腦血管疾病酶活性的試劑盒，其特征在于，進(jìn)一步，所述酶標(biāo)板的材質(zhì)為聚苯乙烯PS。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測(cè)心腦血管疾病酶活性的試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)品臨用前15分鐘內(nèi)配制，以樣品稀釋液稀釋至lml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒、搓動(dòng)以助溶解。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測(cè)心腦血管疾病酶活性的試劑盒，其組成成分包括：酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液、顯色液、酶標(biāo)記物、濃縮洗滌液、終止液和覆膜，用于快速監(jiān)控和預(yù)測(cè)冠心病心肌梗塞和心腦血管血栓發(fā)病前血中Lp-PLA2酶的濃度。通過檢測(cè)循環(huán)系統(tǒng)中的Lp-PLA2酶水平，可以獨(dú)立的預(yù)測(cè)心腦血管的病發(fā)，具有檢測(cè)過程簡(jiǎn)便，快捷，費(fèi)用低，準(zhǔn)確率高的特點(diǎn)，適合推廣應(yīng)用。
【IPC分類】G01N33-573
【公開號(hào)】CN104730241
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510094452
【發(fā)明人】張圓, 劉文蘭, 李維平
【申請(qǐng)人】深圳市第二人民醫(yī)院, 內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院
【公開日】2015年6月24日
【申請(qǐng)日】2015年3月2日