一種無(wú)患子皂甙的hplc檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種植物天然皂甙集合的檢測(cè)，尤其涉及一種無(wú)患子皂甙的高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]無(wú)患子(Sapindus mukorossi)為無(wú)患子屬無(wú)患子科落葉喬木，在世界范圍內(nèi)，約有13個(gè)種類(lèi)分布，主要產(chǎn)于亞洲、美洲和大洋洲；中國(guó)無(wú)患子屬共有4種，主要分布于長(zhǎng)江流域以南地區(qū)。無(wú)患子果皮中含有多種生物活性物質(zhì)，在抗菌、抗腫瘤、抗肝炎、抗胃潰瘍、殺精、殺螺等方面均有大量研宄報(bào)道，此外，由于無(wú)患子果皮中豐富的倍半萜和三萜皂苷含量，賦予其優(yōu)秀的表面活性性能，讓其在開(kāi)發(fā)為各日化用品方面具有巨大潛力而一度成為研宄的熱點(diǎn)。此外，其較強(qiáng)的抗菌、消炎、抗腫瘤、抗生育、促進(jìn)微量元素及藥物吸收等能力，亦賦予了其在日化用品開(kāi)發(fā)之外的潛在研宄價(jià)值。
[0003]目前無(wú)患子皂甙的檢測(cè)方法主要集中在用分光光度法測(cè)定，比色法如:五氯化銻、香草醛硫酸比色或香草醛-冰醋酸-高氯酸比色法測(cè)定。此外還有通過(guò)RP-HPLC法測(cè)定常春藤阜苷元(Hederagenin)或齊墩果酸(Oleanolic acid)的方法來(lái)間接測(cè)定；以巴拿馬樹(shù)皮提取物Quillaja Saponin(QS)為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)測(cè)定無(wú)患子阜苷的含量。但以上方法過(guò)于粗略而不能準(zhǔn)確反應(yīng)無(wú)患子皂苷的真實(shí)成分分布和真實(shí)含量。
[0004]此外，報(bào)道有使用LC-MS法、電噴霧離子化ES1-MS、大氣壓電離子化質(zhì)譜APC1-MS，對(duì)無(wú)患子皂甙進(jìn)行檢測(cè)，雖然此類(lèi)方法可以直接地對(duì)無(wú)患子總皂苷中各種皂苷成分進(jìn)行分離鑒定和分子量測(cè)定，但檢測(cè)儀器昂貴，操作過(guò)程復(fù)雜，普遍推廣使用難度大。
[0005]印度國(guó)家藥物研宄中心⑶RI用HPTLC和LC-MS對(duì)無(wú)患子皂苷指紋圖譜進(jìn)行過(guò)研宄，并用C18柱對(duì)無(wú)患子阜苷B (Sapindoside B)的HPLC檢測(cè)方法進(jìn)行研宄，該方法的預(yù)處理過(guò)程十分復(fù)雜，梯度洗脫基線漂移嚴(yán)重，色譜分離效果較差，樣品測(cè)定結(jié)果的重現(xiàn)性、準(zhǔn)確性等差。發(fā)明人按該方法而HPLC譜圖中一直未得到目標(biāo)峰。
[0006]因此，本領(lǐng)域迫切需要提供一種運(yùn)行時(shí)間適當(dāng)，基線穩(wěn)定，分離度良好，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高的無(wú)患子皂甙的HPLC檢測(cè)方法，以為無(wú)患子的充分開(kāi)發(fā)利用以及加快其商品化進(jìn)程提供一種優(yōu)秀，實(shí)效的工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明旨在提供一種無(wú)患子皂甙的高效液相檢測(cè)方法。
[0008]在本發(fā)明中，上述目的是通過(guò)如下方案實(shí)現(xiàn)的:
一種無(wú)患子皂甙的檢測(cè)方法，包括將待檢測(cè)的無(wú)患子皂甙通過(guò)高效液相色譜分離，其流動(dòng)相為兩種以上極性溶劑的混合溶劑，采用梯度洗脫。
[0009]作為優(yōu)選，其中所述極性溶劑選自乙腈、乙醇、甲醇或水。
[0010]進(jìn)一步的，其流動(dòng)相為乙腈和水的混合物，采用梯度洗脫，乙腈的起始濃度為10-30vol.%，最終濃度為 50-80vol.V0o
[0011]發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研宄，通過(guò)大量的試驗(yàn)，摸索得到了一種無(wú)患子皂甙的HPLC檢測(cè)方法。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了有效分離、檢測(cè)無(wú)患子皂甙的乙腈和水的體積比，進(jìn)一步地，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)在一定的時(shí)間內(nèi)使乙腈和水的體積比逐步變化(即采用一定的濃度梯度洗脫方式)，可以得到更佳的分離、檢測(cè)效果。
[0012]作為優(yōu)選，在本發(fā)明中，濃度梯度優(yōu)選為如下五個(gè)階段:
1)洗脫劑中乙腈在0-20分鐘從10-30vol.%遞增到20-40VO1.% ；
2)洗脫劑中的乙腈在20-35分鐘，從20-40vol.%遞增至40_60vol.% ；
3)洗脫劑中的乙腈從35-45分鐘，保持在40-60vol.% ；
4)洗脫劑中的乙腈濃度在45-55分鐘，從40-60vol.%遞增到70_100vol.% ；
5)洗脫劑中的乙腈在55-60分鐘，從70-100vol.%遞減到50_80vol.%。
[0013]進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，濃度梯度優(yōu)選為如下五個(gè)階段:
(1)所述流動(dòng)相中乙腈在0-20分鐘從23vol.%遞增到30vol.% ；
(2)流動(dòng)相中的乙腈在20-35分鐘，從30vol.%遞增至55vol.% ；
(3)流動(dòng)相中的乙腈從35-45分鐘，保持在55vol.% ；
(4)流動(dòng)相中的乙腈濃度在45-55分鐘，從55vol.%遞增到80vol.% ；
(5)流動(dòng)相中的乙腈在55-60分鐘，從80vol.%遞減到50vol.%。
[0014]在本發(fā)明中，所述HPLC使用反相C18色譜柱，柱溫保持在30_40°C，UV檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為 200-210nm。
[0015]在另一優(yōu)選例中，無(wú)患子阜式樣品的進(jìn)樣濃度為l_3mg/ml。
[0016]在另一優(yōu)選例中，步驟(I)前還包括步驟:
將無(wú)患子原料果皮粉碎，以80被％乙醇按照￠:5:4)的量提取，合并提取液，旋干，真空干燥，研磨。稱取一定量原料粉末，加純化水超聲溶解，定容于1ml容量瓶中，使其成終濃度3-8mg/ml的無(wú)患子原料溶液，用0.45um水系有機(jī)濾膜過(guò)濾，HPLC備用。
[0017]據(jù)此，本發(fā)明提供了一種運(yùn)行時(shí)間相對(duì)較短、基線穩(wěn)定、分離度良好的檢測(cè)無(wú)患子皂苷的HPLC方法。
[0018]本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于:
1、填補(bǔ)國(guó)內(nèi)外無(wú)患子檢測(cè)方法專(zhuān)利的空白，并優(yōu)化該檢測(cè)方法，使目標(biāo)峰的理論塔板數(shù)大大提高，且基線平穩(wěn)，出峰時(shí)間適宜，試劑用量小，峰之間分離度好，能較好地呈現(xiàn)無(wú)患子皂甙的譜圖峰特點(diǎn)，讓HPLC檢測(cè)無(wú)患子皂甙真正達(dá)到了高效、準(zhǔn)確的目的；
2、運(yùn)行時(shí)間相對(duì)較短，為60min;出峰早，10分鐘左右即出現(xiàn)第一個(gè)皂甙吸收峰。
【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1是無(wú)患子主要阜式sapindosideB的結(jié)構(gòu)圖。
[0020]圖2-9為實(shí)施案例1-8的無(wú)患子樣品以UV作為檢測(cè)器的HPLC檢測(cè)圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0021 ] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0022]本發(fā)明中的重量體積百分比中的單位是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
[0023]除非另行定義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的最佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
[0024]本發(fā)明實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)條件如下:
儀器和色譜條件:
儀器:Shimadzu LC-20AT高效液相色譜儀(Shimadzu SFOjOA型號(hào)檢測(cè)器、二元泵) 色譜柱:ffondasil C18for herb medicine 流動(dòng)相A:去離子水(UP)
流動(dòng)相B:乙腈中流速:1.0ml/min 柱溫:40°C
檢測(cè)波長(zhǎng):選用200nm-210nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。
[0025]溶液的制備
對(duì)照品溶液:常春藤阜苷元(Hederagenin)用甲醇超聲溶解，用0.45um—次性針孔過(guò)濾后，HPLC備用。
[0026]樣品溶液:精密稱取一定量事先制備好的干燥的無(wú)患子原料粉末，加純化水超聲溶解，定容于1ml容量瓶中，使其成終濃度3-8mg/ml的無(wú)患子原料溶液，用0.45um水系有機(jī)濾膜過(guò)濾，作為樣品溶液，HPLC備用。
[0027]實(shí)施例1
起始流動(dòng)相A:流動(dòng)相B = 75:25,隨后，流動(dòng)相B連續(xù)性遞增從25%逐漸升到50%洗脫25分鐘，隨后在接下來(lái)的35分鐘內(nèi)，流動(dòng)相B繼續(xù)連續(xù)性遞增，從50%逐漸升至55%，平衡。此方法下，7分鐘后開(kāi)始出現(xiàn)第一組峰，分離度較好，35分鐘以后峰分離不明顯，如，RT = 39.123min處峰，分