一種測定尿液中可替寧含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于尿液代謝物檢驗技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種尿液中可替寧的測定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙堿，俗稱尼古丁，是煙草的重要成分，占煙草中總生物堿的98%。煙堿是吸煙成 癮或煙草依賴的主要因素。進入人體內(nèi)的尼古丁約80%在肝臟中的細胞色素酶P4502A6的 作用下代謝為可替寧?？商鎸庪S血液進入到人體各個部位，在血液、尿液、唾液等體液和肝 臟及腦等器官中均發(fā)現(xiàn)可替寧的分布?？商鎸幵隗w內(nèi)的半減期為18_22h，且由于尼古丁是 可替寧的唯一來源，因此是目前公認的評價卷煙煙氣暴露的特異性生物標志物。
[0003] 由于尿液具有易采集，非創(chuàng)傷性等特點，是生物暴露風險評估中應用最為廣泛的 生物基質(zhì)。尿液中可替寧的測定方法主要有：酶聯(lián)免疫法、毛細管電泳化學發(fā)光法、氣相色 譜質(zhì)譜法、液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS/MS)。LC-MS/MS具有靈敏度高，選擇性 強等特點，前期建立的LC-MS/MS法需要液液萃取或固相萃取凈化尿液樣本。Fan等建立了 一個直接稀釋過濾進樣分析尿液中可替寧的LC-MS/MS方法，此方法簡化了前處理過程，選 取了一根常規(guī)的液相色譜柱（柱徑：4. 6mm，粒徑：5ym)，但其分離的效果不如小粒徑、窄內(nèi) 徑的UPLC色譜柱。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 鑒于此，本發(fā)明目的在于提供一種操作簡便、快速、準確、靈敏度高的尿液中可替 寧含量的測定方法。
[0005] 為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是，提供一種測定尿液中可替寧含 量的方法，包括以下步驟：
[0006] 步驟a)
[0007] 移取尿液于離心管，加入氘代內(nèi)標，用乙腈稀釋；
[0008] 步驟b)
[0009] 將離心管置于渦旋振蕩儀，渦旋振蕩，靜置；吸取上清液經(jīng)有機相濾膜過濾，濾液 待測；步驟c)
[0010] 用甲醇配置可替寧標準儲備液，低溫避光保存；取一定量的儲備液，用甲醇稀釋定 容，制得可替寧工作液；
[0011] 用甲醇準確配置可替寧-d3內(nèi)標儲備液，用內(nèi)標儲備液配制內(nèi)標工作液，低溫避光 保存，使用前將其恢復到室溫；
[0012] 用乙腈配制不同濃度的可替寧標準工作溶液；
[0013] 步驟d)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定
[0014] 吸取配制好的不同濃度的可替寧標準工作溶液，注入UPLC-MS/MS系統(tǒng)，按內(nèi)標法 以峰面積計算出樣品待測液中可替寧含量。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的一個【具體實施方式】，步驟a)中，內(nèi)標濃度為IOyg/mL，加入尿液樣 品、內(nèi)標、乙腈的體積依次為100yL，30yL和870yL。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的一個【具體實施方式】，步驟b)中，禍旋振蕩2min，2400轉(zhuǎn)/min。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的一個【具體實施方式】，步驟c)中，所述低溫避光保存為：選用棕色玻 璃瓶作為容器，放入_20°C保存。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的一個【具體實施方式】，所述步驟d)中測定尿液中可替寧含量的具體 操作為：吸取配制好的不同濃度的可替寧標準工作溶液，注入UPLC-MS/MS系統(tǒng)，繪制可替 寧的線性回歸方程，對純化稀釋后的樣品待測液進行測定，測得分析物與內(nèi)標峰面積的比 值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測液中分析物的含量。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的一個【具體實施方式】，所述UPLC-MS/MS系統(tǒng)的測定條件中：
[0020] 色譜條件：選用色譜柱AtiantisUPLCBEHShieldRPC18,規(guī)格為 50mmX2. 1mm， I. 7ym;流動相A:體積分數(shù)為0.I%的甲酸水溶液，流動相B:0.I%甲酸甲醇溶液；流速 0. 8mL/min，柱溫35°C，進樣量5yL;梯度洗脫；
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，所述梯度洗脫條件：〇~Imin, 98%A~98%A; 1. 1 ~3.Omin，2%A~2%A;3. 01 ~4.Omin, 98%A~98%A。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的一個【具體實施方式】，所述UPLC-MS/MS系統(tǒng)的測定條件中：
[0023] 質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，噴霧電壓（IS) 2. 6kV;離子化溫度350°C;霧化氣流量 1000L/Hr;錐孔氣流量50L/Hr;碰撞氣流量為0. 15ml/min;碰撞氣為氬氣，其余氣體為氮 氣；駐留時間為30msec，正離子MRM模式采集，選取m/z177. 2/98. 0作為定量離子對，m/z 177. 2/80. 1為確認離子對，m/z180. 2/80. 1為對應的氘代內(nèi)標離子對。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的一個【具體實施方式】，所述尿液為冷凍保存尿液，測定前在室溫下解 凍。
[0025] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，上述技術(shù)方案中的一個技術(shù)方案具有如下優(yōu)點：
[0026] 1、與傳統(tǒng)的氣相色譜-質(zhì)譜法比較，本發(fā)明采用乙腈直接稀釋，渦旋振蕩過濾進 樣的方式，簡化了前處理過程，提高了分析靈敏度。
[0027] 2、由于選取了超高效液相色譜柱，使得柱子的分離度明顯提高，分析時間顯著縮 短，提高檢測通量。串聯(lián)質(zhì)譜的使用使得方法的選擇性和靈敏度提高，更有利于非吸煙者或 二手煙接觸者尿液中低含量可替寧的測定。
[0028] 3、選取了乙腈稀釋與沉淀尿液中蛋白方法，氘代內(nèi)標定量，有效消除基質(zhì)干擾和 前處理過程中引起的誤差。
[0029]4、本方法具有操作簡便、快速、準確、靈敏度及重復性好的優(yōu)點。
【附圖說明】
[0030] 圖1是本發(fā)明一較佳實施例的尿液樣品中可替寧的選擇離子流色譜圖。
[0031] 圖2是本發(fā)明一較佳實施例的尿液樣品中氘代可替寧的選擇離子流色譜圖。
【具體實施方式】
[0032] 下面結(jié)合一個具體實施例進行說明。
[0033] 本實施例中尿液中可替寧含量的測定方法，依次采用乙腈稀釋與沉淀蛋白，氘代 內(nèi)標定量，渦旋振蕩凈化，有機相濾膜過濾，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，可快速、準 確、同時檢測出、尿液中可替寧的含量。
[0034] 本實施例所用儀器和試劑為：
[0035] WatersXevoTQ超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司），配備電噴霧 電離源（ESI);VtexMixer230VeU振蕩器（美國Labnet公司）。
[0036]甲酸為HPLC級（濃度為49-51 %，德國Sigma公司）；乙腈、甲醇均為色譜純（美 國Thermo-Fisher公司）；可替寧，可替寧_d3(純度：98 % ;同位素純度：99%，Toronto ResearchChemicalsInc. )〇
[0037] I、提取尿液中的分析物
[0038] 取冷凍尿液樣品，于室溫下解凍，混合均勻后，取100yL的尿液并加入30yL的氘 代內(nèi)標，加入870yL乙腈，在2400轉(zhuǎn)/分鐘的條件下渦旋振蕩2min。上清液過0. 22ym有 機相濾膜，取5yL濾液用于LC-MS/MS分離分析。
[0039]2、UPLC-MS/MS測定
[0040] (I)UPLC-MS/MS條件：
[0041] 色譜條件：AtiantisUPLCBEHShieldRPC18(50mmX2. 1mm，I. 7um，美國Waters 公司）；流動相A:體積分數(shù)為0.I%的甲酸水溶液，流動相B:0.I%甲酸甲醇溶液；流速 0? 8mL/min，