可以在用于氧化的表面的涂層劑、增粘劑或粘合劑中使用的肽的制作方法
【專利說明】可以在用于氧化的表面的涂層劑、增粘劑或粘合劑中使用 的肽
[0001] 本發(fā)明涉及用于氧化的表面的涂層劑、增粘劑或粘合劑，含肽，尤其是十二肽，涉 及含有完全或部分由十二肽組成的化合物的多層復(fù)合物或經(jīng)涂覆的基質(zhì)，所述化合物作為 所述復(fù)合物的至少兩個相鄰層之間或涂層與基質(zhì)之間的增粘劑，還涉及可以用作用于氧化 的表面的涂層劑、增粘劑或粘合劑的十二肽。
[0002] 在氧化的表面的涂層或著色的領(lǐng)域，已知的促進粘附的方法涉及雙功能的有機硅 烷化合物，例如，所述方法建立了涂料的聚合物基體和無機基質(zhì)之間的化學(xué)鍵。這些增粘劑 的缺點之一是僅當(dāng)可以與硅烷相互作用的羥基基團存在于基質(zhì)的表面上，才能確保最佳粘 附。因此，許多情況下，基質(zhì)的復(fù)雜預(yù)處理對于表面的硅烷化是必要的。另外，定制材料的 制造是非常復(fù)雜的，此外，并不是對于所有基質(zhì)，定制材料都是已知的。
[0003] 自1940年以來，對自組裝單層膜（SAM，也稱為自組織單層膜）進行了研宄和描述， 但直到1983年人們才開始努力對這種組織方法的進行技術(shù)利用。
[0004] 原則上，自組裝單層膜有兩個不同的活性基團，在它們之間存在間隔物，例如脂肪 族間隔物。其一個基團與表面相互作用，而另一端的基團具有特定性質(zhì)或連接到另一個官 能化合物。SAM形成抵抗水的侵害的化學(xué)鍵，同時，所述化學(xué)鍵能夠防止所有在夾層的電化 學(xué)反應(yīng)。在固體表面上的單分子層的自組織提供用于生產(chǎn)具有一定組成、結(jié)構(gòu)以及厚度的 夾層的有效方法。選擇性自組織增粘劑具有的優(yōu)點是，它們保證涂料層和粘合劑層以長使 用壽命粘附到金屬表面，這在汽車領(lǐng)域是必要的，例如防腐蝕的進一步改進。所述自組織增 粘劑還允許均勻的涂料層的一貫良好地粘附在復(fù)合材料上，其正在越來越多地使用，并且 具有不同的表面，如塑料-金屬復(fù)合材料。
[0005] 自組織單層用于半導(dǎo)體技術(shù)，例如，對于電極的表面穩(wěn)定化和定制官能化。滲透性 和電荷傳送速率收到影響，取決于所用的烷基鏈的長度。應(yīng)用自組織單層膜的領(lǐng)域非常廣 闊。自組織單層膜的技術(shù)尤其應(yīng)用于電化學(xué)掃描隧道顯微鏡、細胞研宄、傳感器系統(tǒng)和納米 電子學(xué)。然而，在現(xiàn)有技術(shù)中所描述的SAM的生產(chǎn)復(fù)雜且成本高。
[0006] 無機基質(zhì)和生物學(xué)成分耦合以修飾表面特性在仿生學(xué)中是已知的。從噬菌體文庫 選擇的呈現(xiàn)短肽的噬菌體已用于，例如，沉淀和分離無機材料（W0 2003/078451)。此外，無 機基質(zhì)和特異性肽配體組成的混合材料被用作改變基質(zhì)表面的潛在方法。然而，鑒定與基 質(zhì)匹配的生物配體（通常是肽）耗時且成本高，并且在此之前已排除具體應(yīng)用。在現(xiàn)有技 術(shù)中提出了用于結(jié)合兩個無機成分的雙功能配體概念。特別地，例如，在WO 2004/035612 中描述了，通過有雙功能結(jié)合性質(zhì)的噬菌體，將細胞或生物分子與聚合物基質(zhì)，尤其是摻雜 氧化氯的聚吡咯（PPyCI)或聚（乳酸共乙醇酸）（PLGA)結(jié)合。沒有進一步描述進一步結(jié)合 到另一種物質(zhì)，其不是所用噬菌體的生物學(xué)結(jié)合伴侶，例如涂層材料；這種結(jié)合同樣將必須 選擇性發(fā)生以及需要配體和進一步的結(jié)合成分的完全匹配。
[0007] 因此，對于提供新型化合物有很大的需求，所述化合物適合于在氧化的表面上使 用，以及避免所述的現(xiàn)有技術(shù)的缺點。
[0008] 已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，某些十二肽用作用于氧化的表面的涂層劑、增粘劑或粘合 劑具有優(yōu)勢。
[0009] 因此，本發(fā)明的主題涉及一種定量方法，用于確定粘附的肽，尤其是十二肽在氧化 的表面上的粘附性質(zhì)，其特征在于：
[0010] a)將含肽溶液施加到有氧化的表面的運載體，并使其干燥，
[0011] b)通過洗滌，從所述運載體上去除未結(jié)合的肽，并使運載體干燥，
[0012] c)用染色溶液對粘附于運載體的肽進行染色，將剩余的染色溶液洗掉，并使所述 運載體干燥，
[0013] d)用提取溶液將粘附于運載體的染色的肽從運載體上去除，含有染色的肽的上清 經(jīng)過分光光度計測量。
[0014] 優(yōu)選地，根據(jù)的發(fā)生通過所述肽的簡單非特異性的染色，例如使用考馬斯染色溶 液的染色，或者通過導(dǎo)致特異性結(jié)合的化學(xué)反應(yīng)，與例如茚三酮的化學(xué)反應(yīng)，進行本發(fā)明的 方法的步驟C)中的染色。
[0015] 尤其有利地，本發(fā)明的定量方法的步驟a)到d)如下實施：
[0016] 在步驟a)中，將2份10 yL的肽溶液，濃度為2mg/mL，溶于1XPBS，pH 7. 4來 自Gibco,施加到直徑為2. 3cm的圓形H⑶鋼板，其中第一個10 μ L干燥大約15分鐘，第 二個10 μ L隨后滴到相同的位置，干燥30分鐘，接著在來自UVP Laboratory Products的 HB-1000雜交爐里，在30°C，存在200毫升水的情況下干燥。
[0017] 在步驟b)中，將板置于直徑19cm的含有1升pH 7. 4的PBS的用于洗滌的結(jié)晶皿 中，并以60rpm在來自B. Braun的Certomat U水平搖床中在室溫輕微搖動10分鐘，并隨后 在30 °C下干燥。
[0018] 在步驟c)中，將所述板轉(zhuǎn)移到6孔皿中，并將150 μ L的考馬斯藍染色溶液用移 液管吸取到所述板上，所述溶液配方為含有2g考馬斯亮藍R-250、0. 5g考馬斯亮藍G-250、 50mL甲醇、425mL乙醇、IOOmL冰醋酸，加入蒸餾水到1000毫升，30秒后，將6mL lXPBS，pH 7. 4小心地加在皿的邊緣以沖洗掉染色溶液，并兩次將所述板移入6mL I XPBS，pH 7. 4中 以去除剩余的染色溶液，之后將所述板在30°C短暫干燥。
[0019] 在步驟d)中，將20 μ L體積比9 :1的DMS0/CH3C00H提取溶液用移液管吸取到染 色斑點上，允許所述提取溶液在室溫作用5分鐘，隨后通過用移液管吹打直到斑點完全從 所述板上去除，將液體取出，將上清液轉(zhuǎn)移到一個反應(yīng)容器中，之后2 μ L的上清液在來自 PeqLab的Nanodrop 1000分光光度計中測量，選擇602nm的UV VIS程序，以確定與氧化的 表面上的肽的粘附強度相關(guān)的顏色強度。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的適合的氧化的表面的實例是鋼、玻璃、石英、金屬氧化物（例如B20 3、 Al203、Si02、Fex0 y)、陶瓷、磷酸鹽化的鐵、巖石、磚和混凝土，尤其優(yōu)選鋼。角蛋白纖維和氧化 的聚合物或適當(dāng)功能化的聚合物也可以形成根據(jù)本發(fā)明的適合的氧化的表面。
[0021] 有利地，根據(jù)本方明的定量方法允許客觀測定氧化的表面上的肽的粘附強度，尤 其是鋼表面上的十二肽。
[0022] 本發(fā)明進一步的主題涉及肽，尤其是十二肽，其在根據(jù)本發(fā)明的定量方法步驟d) 中的測量中，吸收范圍為〇. 25-1，優(yōu)選為0. 4-1，更優(yōu)選為0. 5-1，特別優(yōu)選為0. 6-1，以及非 常特別優(yōu)選為〇. 7-1。
[0023] 借助于根據(jù)本發(fā)明的定量方法，已經(jīng)鑒定了其氨基酸序列對應(yīng)于表1中所示的序 列模式的十二肽，其中"X"代表任何氨基酸；這些十二肽代表了本發(fā)明的進一步的主題。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的十二肽是那些在十二個位置的至少八個對應(yīng)于表1中所示的 序列模式的十二肽。特別優(yōu)選的十二肽是那些在十二個位置的至少十個符合表1中所示的 序列模式的十二肽。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明非常特別優(yōu)選的十二肽是表1中所列的肽8和9,以及表2中所列的肽 6和7〇
[0026] 本發(fā)明的進一步主題涉及表2中所列的肽10、13、15和17尤其是肽13和15。
[0027] 本發(fā)明的進一步主題涉及編碼本發(fā)明的肽的核酸，特別是表3中所列的核酸序 列。
[0028] 在本專利申請的意義上說，肽是指由天然氨基酸組成的聚合物，具有大的線型結(jié) 構(gòu)，且比天然蛋白質(zhì)小。在本專利申請中，19個蛋白原的，天然存在的L-氨基酸由國際通用 的單字母和三字母代碼表示。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的肽，尤其是十二肽，可用已知的肽合成方法化學(xué)生產(chǎn)，例如通過根據(jù) Merrifield的固相合成。
[0030] 然而，優(yōu)先使用重組方法生產(chǎn)本發(fā)明的肽，尤其是十二肽。根據(jù)本發(fā)明，這是指基 于將感興趣的肽的基因?qū)脒m于生產(chǎn)