一種膿毒癥診斷方法及試劑的制作方法
【專利說明】
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于感染炎癥類疾病的危重程度判定和預(yù)后評估技術(shù)領(lǐng)域，即膿毒癥 (Sepsis)的多器官功能障礙的判定和預(yù)后評估。具體而言本發(fā)明提供了一種從線粒體亞細 胞水平對膿毒癥的診斷、危重程度監(jiān)測和預(yù)后評估的檢測方法，該檢測方法主要是測定線 粒體呼吸鏈超復(fù)合物NADH-細胞色素C氧化還原酶（NADH: cytosome C oxidoreductase， NCR )的酶活性，同時本發(fā)明還提供了作為線粒體NCR的酶活性分析和檢測的方法和試劑。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004] 膿毒癥（Sepsis)是指由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征（Systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，是由于微生物（如細菌、真菌、病毒、寄生蟲等） 侵入人體而誘發(fā)的激烈全身炎癥反應(yīng)，并對組織具有損傷性的病理生理過程的一組臨床表 現(xiàn)，常常繼發(fā)于嚴重疾病，如嚴重?zé)齻?、多發(fā)傷、外科手術(shù)后等。嚴重膿毒癥可以導(dǎo)致膿毒性 休克、多器官功能障礙（Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，是重癥監(jiān)護病房 內(nèi)非心臟病死亡的主要原因。近年來，盡管抗感染治療和器官功能支持技術(shù)取得了長足的 進步，膿毒癥的病死率仍高達30%~70%，全球每天約14, 000人死于其并發(fā)癥，對人類健康 和經(jīng)濟發(fā)展構(gòu)成極大的威脅和挑戰(zhàn)。
[0005] 臨床實踐表明，膿毒癥的許多特異性治療手段如抗炎治療、促炎治療、皮質(zhì)激素 的使用等都是非常危險的"雙刃劍"，這些治療的選擇必須在對病人進行正確分級、分期的 基礎(chǔ)上進行。僅僅根據(jù)臨床表現(xiàn)和非特異性的實驗室數(shù)據(jù)，盲目使用很可能導(dǎo)致病情惡化 和臟器功能衰竭，以及對醫(yī)療資源的浪費。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)很多生物標 志物可用于膿毒癥的早期診斷、病情及預(yù)后判斷、療效評估，并以此判斷疾病的病理生理狀 態(tài)，從而指導(dǎo)治療。有效的生物學(xué)標志物檢測成為了膿毒癥診斷治療的重要手段，其中比較 有價值的生物標志物有C反應(yīng)蛋白、降鈣素原、sTREM-1、NT-proBNP以及部分細胞因子和 白細胞分化抗原等。
[0006] C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP)系急性時相蛋白，不僅能夠與細菌、真菌 等微生物的多聚糖結(jié)合，而且可激活補體系統(tǒng)，促進噬菌作用。CRP由肝實質(zhì)細胞產(chǎn)生，正 常人群水平在10 mg /L以下，感染發(fā)生后4~6 h即開始升高，36~50 h達高峰，峰值 可達正常參考值的數(shù)百倍，感染消除后其水平急驟下降，1周內(nèi)可恢復(fù)至正常，而在病毒感 染時無顯著升高，這為早期感染類型的鑒別提供了極其重要的依據(jù)。因此，作為相關(guān)的非特 異性炎性標志物被廣泛應(yīng)用。但CRP對膿毒癥的診斷價值差異較大，其作為成人膿毒癥生 物標志物具有較低的特異性，通常用于新生兒早期膿毒癥的篩查。此外，其他炎癥性疾?。?如燒傷、創(chuàng)傷、大手術(shù)、惡性腫瘤等）也可導(dǎo)致CRP明顯升高。
[0007] 降鈣素原（Procalcitonin，PCT)是降鈣素激素的前體，被視為細菌感染的可靠 生物標志物之一。研宄顯示，正常人血清PCT濃度低于0. lug/L，非特異性感染、病毒性炎癥 及局部感染等疾病時不增加或輕微增加，感染后2 h即可在血漿中迅速檢測到，嚴重感染時 可升高2000倍以上，PCT半衰期為22~26h，與CRP等急性時相蛋白相比更具優(yōu)勢。研宄證 明PCT的最佳閾值為0. 47 μ g/L時，其對膿毒癥的診斷靈敏度和特異度分別為83%和81%。 但也有研宄者質(zhì)疑PCT對膿毒癥的診斷和預(yù)后的準確性，認為PCT并不與感染嚴重程度 相一致。一項就PCT對膿毒癥診斷價值薈萃分析發(fā)現(xiàn)，其平均靈敏度和特異度只有71%，受 試者工作特征曲線下面積也只有0.78。雖然如此，目前，PCT水平已被用于指導(dǎo)急性慢性支 氣管炎加重，社區(qū)獲得性肺炎（CAP)及膿毒癥的實驗性抗菌治療。并且，PCT水平還可以和 常規(guī)的臨床參數(shù)一起輔助判斷患者的實驗性抗菌治療是否有效。通過連續(xù)監(jiān)測PCT水平來 判斷是否可以結(jié)束抗菌素治療是其最有價值的應(yīng)用。
[0008] 髓系細胞表達觸發(fā)受體-I(TREM-I)屬于免疫球蛋白超家族，選擇性地表達于中性 粒細胞和部分單核細胞，在多種炎癥反應(yīng)中表達上調(diào)。機體在細菌或真菌感染時中性粒細 胞和單核-巨噬細胞表面表達TREM-I顯著增加，脫落入血即sTREM-1 (可溶性髓系細胞表 達觸發(fā)受體1)。研宄證明，在區(qū)分膿毒癥和非感染性炎癥時，sTREM-1是一個非常有意義的 早期參數(shù)。雖然如此，一項對11個研宄(包括1795例患者）的薈萃分析發(fā)現(xiàn)，sTREM-1對膿 毒癥的診斷的整體靈敏度和特異性分別為79% (95%置信區(qū)間，65~89)和80% (95%置信區(qū) 間，69~88)，ROC曲線下面積為0. 87 (95%置信區(qū)間，0. 84~0. 89)。最終得出，血漿sTREM-1 在區(qū)分膿毒癥及SIRS中表現(xiàn)中等，不足以用于系統(tǒng)性炎癥患者的膿毒癥診斷。
[0009] 尿鈉肽（BNP)為活化的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，由心室肌細胞產(chǎn)生，心肌壁及心室壁壓 力的增加為主要刺激源，促進BNP的釋放。BNP的生理學(xué)效應(yīng)包括利尿、拮抗腎素-血管緊 張素-醛固酮系統(tǒng)及刺激鳥苷酸環(huán)化酶引起血管擴張。NT-proBNP為BNP前體氨基末端， 心室容積擴大及心力衰竭時，血漿BNP和NT-proBNP水平升高，是一種有效的心室前負荷和 心功能預(yù)測標志物。膿毒癥早期常出現(xiàn)血流動力學(xué)改變和心臟功能障礙。據(jù)報道，膿毒癥、 膿毒性休克及急性心衰與BNP和NT-proBNP水平升高有關(guān)。且因NT-proBNP在血液循環(huán)中 比尿鈉肽有更長的半衰期，這使得它具有更好的敏感性和特異性。統(tǒng)計分析57例膿毒癥患 者的數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，血漿B型尿鈉肽前體N末端水平在嚴重膿毒癥時可作為一個早期心功 能障礙和心肌抑制有用的生物指標，如果閾值定在3360 ng /L，其靈敏度為75%，特異性為 90. 2%〇
[0010] 細胞因子中有代表性的包括白細胞介素家族（IL-1、2、4、6、8、10及12)、腫瘤壞死 因子（TNF)、干擾素、巨噬細胞炎癥蛋白（MIP)、干擾素誘導(dǎo)蛋白10 (IP-10)、高迀移率族蛋 白BI (HMGBl)等。這些因子在膿毒癥早期有一定的診斷價值，其中研宄較多的IL-6-般 認為對膿毒癥有重要的預(yù)測價值，且IL-6有緩慢而穩(wěn)定的動力學(xué)特征，容易在血液中被檢 測，成為膿毒癥的重要細胞因子生物標志物。研宄表明，膿毒癥患者血IL-6水平明顯增高， 且膿毒癥的嚴重程度及預(yù)后與其增高幅度相關(guān)，IL-6水平持續(xù)增高者多器官功能障礙綜合 征的發(fā)生率和病死率明顯增加，如以25 ng /L為閾值時，對膿毒癥有較高的診斷價值，其靈 敏度為81. 1%，特異度為78. 9%。但也有研宄顯示，IL-6水平在全身炎性反應(yīng)綜合征和膿毒 癥之間的差別不大，診斷膿毒癥的靈敏度（67%)和特異度（65%)不高。
[0011] 白細胞分化抗原是白細胞表面標志物，其異常表達通常意味著白細胞數(shù)目和功能 的變化，故可能作為膿毒癥的標志物，迄今報道的表面抗原包括⑶10、11、14、18、25、28、40、 48、64、69、80及163等。其中⑶64研宄較多，它選擇性表達于單核/巨噬細胞，正常人成熟 中性粒細胞不表達。研宄發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者中性粒細胞表面⑶64表達增加，可刺激并誘導(dǎo)炎 癥介質(zhì)γ -干擾素和粒細胞集落刺激因子（G-CSF)的釋放。中性粒細胞表面CD64可以作 為區(qū)分感染、膿毒癥和嚴重組織損傷的診斷性生物標志物，在膿毒癥的早期診斷中其敏感 性和特異性分別為65. 8%和64. 6%。另外，在炎癥期，血漿蛋白酶水解CD14產(chǎn)生可溶性片段 (s⑶14)，其中稱為s⑶14亞類（s⑶14-ST)或pres印sin的組分，在健康人體血清中濃度很 低，但在細菌感染后升高，近期的兩個研宄發(fā)現(xiàn)presepsin是早期診斷膿毒癥及評估膿毒 癥患者預(yù)后的有效生物標志物(靈敏度為71~72%，特異性為70~86%)。
[0012] 其它生物標志物還有熱休克蛋白70(Hsp70)、內(nèi)皮素-1前體（proET-Ι)、血管生成 素-I (Ang-I )、巨噬細胞移動抑制因子（MIF)、可溶性尿激酶型纖溶酶原激活受體（suPAR) 凝血因子、細胞凋亡產(chǎn)物、激素水平、調(diào)節(jié)性T細胞（Treg)、病原微生物本身及其產(chǎn)物（內(nèi)毒 素、核酸）等，但這些標志物對膿毒癥的預(yù)測靈敏度和特異性相對較差，臨床認可度和使用 率較低。
[0013] 由于膿毒癥是一組綜合征，機體的病理生理反應(yīng)過程具有不同的階段性特點，發(fā) 病表現(xiàn)多樣、發(fā)病機制復(fù)雜，目前還沒有一個標志物的變化能完全反應(yīng)其整個過程，沒有一 個標志物的能獨立的用于膿毒癥的各期預(yù)測、診斷、治療監(jiān)測及預(yù)后判斷。尋找高靈敏度及 特異性的膿毒癥生物標志物、分析各種標志物及其