桉樹有機酸種類和含量的檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及本發(fā)明涉及一種檢測低分子量有機酸方法，特別是一種桉樹有機酸種 類和含量的檢測方法。
【背景技術】
[0002] 植物根系分泌的有機酸可以降低根際土壤的pH值，同時可與鋁、鐵、鈣等金屬元 素形成螯合物，提高根際土壤養(yǎng)分的有效性，從而促進植物生長。而植物組織中的有機酸具 有調(diào)節(jié)植物細胞新陳代謝、固定植物養(yǎng)分、參加光合作用和呼吸作用，還可以作為代謝活性 溶質，調(diào)節(jié)滲透壓，平衡過多的陽離子。桉樹是我國熱帶亞熱帶地區(qū)極為重要的速生用材樹 種，其所生長的南方土壤屬于富鋁化酸性土壤的酸化程度，極易產(chǎn)生活性鋁的積累，對植物 的生長產(chǎn)生抑制作用。有研宄表明，植株體內(nèi)及其分泌物有機酸與鋁離子形成的毒性較低 的鋁-有機酸螯合物，可有效地降低生長介質中離子態(tài)鋁的活性，減少了活性鋁離子對植 株的毒害，目前在大豆、小麥、玉米等農(nóng)作物上開展了較多的研宄，而在林木方面上的研宄 較少，對桉樹有機酸的鑒定未見報道。建立一種簡便、快速和高效測定桉樹植株及根分泌有 機酸含量的新方法，對研宄林地地力衰退問題及進一步探索富鋁化酸性土壤人工林對鋁毒 害緩解的作用具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種桉樹有機酸種類和含量的檢測方法，以ICS 為核心技術，對以往氯離子干擾部分常見有機酸的測定進行了優(yōu)化，建立一種能同時檢測 多種低分子有機酸的方法，方法簡便、快速，檢測效果好。
[0004] 本發(fā)明通過以下技術方案達到上述目的：一種桉樹有機酸種類和含量的檢測方 法，包括以下步驟：
[0005] (1)離子色譜儀（ICS-5000, USA)的測定條件：分析柱ASl I-HC (4 X 250mm)及保護 柱AGlI-HC (4X 50mm)，流動相為KOH梯度淋洗液，ASRS_4mm型抑制器再生模式，⑶電導檢 測器，EG-30淋洗液發(fā)生器，柱溫35°C，進樣量25 μ L ;
[0006] (2)制作標準曲線：配制乙酸、甲酸、蘋果酸、酒石酸、草酸、檸檬酸、順烏頭酸的混 合標準溶液，藥品均為Aladdin色譜純級別產(chǎn)品，通過對有機酸濃度和進行線性回歸，得到 相關線性方程；以有機酸濃度和ICA圖譜峰面積定量，建立標準曲線；
[0007] (3)供試材料準備：以2個月生巨尾桉廣林9號，尾葉桉4號為試驗材料，用0. 1 % 多菌靈消毒根系20min后，采用水培法收集根系分泌的有機酸；
[0008] (4)根系分泌的有機酸的收集：不同時間段處理實驗結束后，立即將處理植株提 起至根系不滴水為止，時間為30~50s，收集含有機酸分泌物的處理溶液；
[0009] (5)根系分泌的有機酸的純化：首先將處理溶液經(jīng)過混合素纖維膜減壓過濾收集 濾液50ml，濾液經(jīng)過內(nèi)部填充8mlH +型陽離子交換樹脂Amberlite IR-120B，USA的陽離子 交換柱15_X 11cm，去掉收集液中的陽離子，收集液承接于濃縮瓶中，于旋轉蒸發(fā)儀R215， Switzerland在40°C水浴中減壓旋轉濃縮蒸發(fā)至干燥，殘留物用超純水溶解后用0. 45 μ m 的微孔濾膜后用ICS-5000測定；
[0010] (6)根系、葉片有機酸的收集
[0011] 植物組織提取有機酸根系〇-3cm稱取0. 2g，葉片稱取0. 5g，置于預冷研缽中，加入 2ml超純水和少許石英砂，冰浴環(huán)境研磨成勻漿，移入IOml離心管中以Iml超純水分3次洗 滌研缽并轉入離心管，總體積為5ml ;
[0012] (7)根系、葉片有機酸的純化
[0013] 在4°C下以5000r/min離心30min，上清液首先經(jīng)過內(nèi)部填充2mlH+型陽離子交換 樹脂Amberlite IR-120B，USA的陽離子交換柱15mmX Ilcm去掉收集液中的陽離子，再經(jīng)過 戴安預處理小柱RP，USA吸附植物色素過0. 45 ym的微孔濾膜后用ICS-5000測定；
[0014] (8)低分子量有機酸的檢測
[0015] 采用自動進樣器進樣，按色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算得到有機酸的種類 和含量。
[0016] 本發(fā)明的方法具有操作簡便，檢測速度快，靈敏度高，準確性強，重復性好，適用于 桉樹根、葉器官及根系分泌的乙酸、甲酸、蘋果酸、酒石酸、草酸、檸檬酸、順烏頭酸等低分子 量有機酸的檢測。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合實施例對本發(fā)明的技術方案進一步說明。
[0018] 實施例1
[0019] 1.七種混合低分子量有機酸標準溶液配制及標準曲線繪制方法
[0020] (1)分別準確稱量200、400、800mg的乙酸、甲酸、蘋果酸、酒石酸、草酸、檸檬酸、順 烏頭酸，用5mL的Imol · Γ1色譜純級氫氧化鈉溶解以上混合物于燒杯中，而后用溶解液定 容至100mL，最終配制成有機酸濃度梯度分別為2、4、8 μ g · ml/1的混合標準溶液。
[0021] (2)采用離子色譜譜儀ICS-5000進行測定，測定條件：分析柱ASll-HC(4X250mm) 及保護柱AGl I-HC (4 X 50mm)，流動相：Κ0Η梯度淋洗液見表1，ASRS_4mm型抑制器再生模式， ⑶電導檢測器，EG-30淋洗液發(fā)生器，柱溫35°C，進樣量25 μ L，以峰面積定量。采用梯度洗 脫方法。
[0022] 表1淋洗液梯度程序
[0023]
【主權項】
1.桉樹有機酸種類和含量的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 離子色譜儀（ICS-5000, USA)的測定條件：分析柱ASlI-HC (4X 250mm)及保護柱 AGl I-HC (4 X 50mm)，流動相為KOH梯度淋洗液，ASRS_4mm型抑制器再生模式，⑶電導檢測 器，EG-30淋洗液發(fā)生器，柱溫35°C，進樣量25 y L ; (2) 制作標準曲線：配制乙酸、甲酸、蘋果酸、酒石酸、草酸、檸檬酸、順烏頭酸的混合標 準溶液，藥品均為Aladdin色譜純級別產(chǎn)品，通過對有機酸濃度和進行線性回歸，得到相關 線性方程；以有機酸濃度和ICA圖譜峰面積定量，建立標準曲線； (3) 供試材料準備：以2個月生巨尾桉廣林9號，尾葉桉4號為試驗材料，用0. 1 %多菌 靈消毒根系20min后，采用水培法收集根系分泌的有機酸； (4) 根系分泌的有機酸的收集：不同時間段處理實驗結束后，立即將處理植株提起至 根系不滴水為止，時間為30~50s，收集含有機酸分泌物的處理溶液； (5) 根系分泌的有機酸的純化：首先將處理溶液經(jīng)過混合素纖維膜減壓過濾收集濾 液50ml，濾液經(jīng)過內(nèi)部填充8mlH+型陽離子交換樹脂Amberlite IR-120B，USA的陽離子 交換柱15_X 11cm，去掉收集液中的陽離子，收集液承接于濃縮瓶中，于旋轉蒸發(fā)儀R215， Switzerland在40°C水浴中減壓旋轉濃縮蒸發(fā)至干燥，殘留物用超純水溶解后用0. 45 ym 的微孔濾膜后用ICS-5000測定； (6) 根系、葉片有機酸的收集 植物組織提取有機酸根系〇-3cm稱取0. 2g，葉片稱取0. 5g，置于預冷研缽中，加入2ml 超純水和少許石英砂，冰浴環(huán)境研磨成勻漿，移入IOml離心管中以Iml超純水分3次洗滌 研缽并轉入離心管，總體積為5ml ; (7) 根系、葉片有機酸的純化 在4°C下以5000r/min離心30min，上清液首先經(jīng)過內(nèi)部填充2mlH+型陽離子交換樹脂 Amberlite IR-120B，USA的陽離子交換柱15mmX Ilcm去掉收集液中的陽離子，再經(jīng)過戴安 預處理小柱RP，USA吸附植物色素過0. 45 ym的微孔濾膜后用ICS-5000測定； (8) 低分子量有機酸的檢測 采用自動進樣器進樣，按色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算得到有機酸的種類和含 量。
【專利摘要】桉樹有機酸種類和含量的檢測方法，包括以下步驟：準備桉樹試驗材料；根據(jù)檢測內(nèi)容確定淋洗液梯度程序，制備有機酸混合標準溶液，擬合有機酸濃度和圖譜峰面積的線性回歸方程，檢測實驗室及進樣器環(huán)境保持恒溫；提取樣品有機酸，去除樣液雜質、色素、陽離子的干擾，并設計相應的濃縮倍數(shù)；采用自動進樣器進樣，記錄峰面積，根據(jù)有機酸混合溶液標準曲線，計算得到樣品有機酸的種類和含量。本發(fā)明的檢測方法，能顯著分開干擾離子，對色譜柱損耗小，檢測速度快，靈敏度高，準確性強，重復性好，適用于檢測植物各部位的低分子有機酸定性、定量檢測。
【IPC分類】G01N30-02
【公開號】CN104807901
【申請?zhí)枴緾N201510209866
【發(fā)明人】楊梅, 戴勤, 葉紹明, 譚玲, 蔣維昕, 趙毅輝
【申請人】廣西大學
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年4月29日