高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測血清中10種類固醇激素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于血液檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測血清中 10種類固醇激素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 類固醇激素是一類脂溶性小分子激素，是由膽固醇經(jīng)一系列酶催化而來。本發(fā)明 主要針對其中對人體生長發(fā)育、性成熟及新陳代謝所必須的10種類固醇激素進(jìn)行分析， 包括脫氛表雄酬（dehydroepiandrosterone, DHEA)、睪酬（testosterone，T)、雙氛睪酬 (dihydrotestosterone，DHT)、雄稀二酮（androstenedione，AD)、雌酮（estrone, El)、皮 質(zhì)酮（corticosterone, C0RT)、孕酮（progesterone, P4)、孕稀醇酮（pregnenolone，P5)、 17 α -輕孕酮（17 α -Hydroxyprogesterone, 17 α -〇HP4)和 17-輕孕稀醇酮（17-hydroxylp regnenolone, 17-OHP5)〇
[0003] 其中，DHEA是一種非常重要的荷爾蒙，可使人改善記憶力，恢復(fù)性能力，降低血液 中的膽固醇，并能抵抗肥胖、心臟疾病與壓力，還能強(qiáng)化免疫系統(tǒng)。脫氫表雄酮過低可能引 起糖尿病、免疫力不足、癌癥、高血壓及心臟病等重大疾病。17 a -OHP4和CORT增高可能引 起先天性腎上腺皮質(zhì)增生，腎上腺腺瘤或卵巢腫瘤。T可增進(jìn)記憶力、增加肌肉強(qiáng)度、減少脂 肪、增加骨頭硬度。DHT的作用主要是維持產(chǎn)生精子作用，刺激生殖器官的發(fā)育，維持正常的 性欲，同時還能促進(jìn)骨骼生長與鈣磷的沉積和紅細(xì)胞的生成。AD升高可引起痤瘡，先天性腎 上腺皮質(zhì)增生，腎上腺皮質(zhì)腫瘤等；AD降低可使得男性發(fā)育延遲，侏儒癥，腎上腺皮質(zhì)功能 減退癥，鐮狀紅細(xì)胞性貧血。
[0004] 總之，人體類固醇激素的升高或者降低與一些臨床疾病如先天性腎上腺增生、多 囊卵巢綜合癥、腎上腺皮質(zhì)功能不全等疾病息息相關(guān)，其在血清中含量的高低對于評估人 體健康是至關(guān)重要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測血清中 10種類固醇激素的方法。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0007] 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測血清中10種類固醇激素的方法，
[0008] 所述的10種類固醇激素分別為：脫氫表雄酮、睪酮、雙氫睪酮、雄烯二酮、雌酮、皮 質(zhì)酮、孕酮、孕烯醇酮、17 α -羥孕酮和17-羥孕烯醇酮；
[0009] 采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測經(jīng)過預(yù)處理的血清中的上述10種類固醇激 素，先利用高效液相色譜將10種類固醇激素分離，再利用質(zhì)譜同位素內(nèi)標(biāo)定量法，以標(biāo)準(zhǔn) 品與內(nèi)標(biāo)物的濃度比為X軸，標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為Y軸，建立校準(zhǔn)曲線，計(jì)算上述 10種類固醇激素的含量，具體色譜條件為：
[0010] (1)高效液相色譜條件：
[0011] 流動相A :0· 1 % v/v甲酸水溶液；
[0012] 流動相B :0· 1% v/v甲酸的甲醇溶液；
[0013] 色譜柱型號：Phenomenex C18100mmX 2. 1mm，2. 6 μ m ;
[0014] 采用梯度洗脫的方式，見表1 ;
[0015] 流速為0· 5mL/min，柱溫為35°C，進(jìn)樣體積為20 μ L ;
[0016] 表1流動相梯度洗脫參數(shù)
[0017]
【主權(quán)項(xiàng)】
1.高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測血清中10種類固醇激素的方法，其特征在于， 所述的10種類固醇激素分別為：脫氫表雄酮、睪酮、雙氫睪酮、雄烯二酮、雌酮、皮質(zhì) 酮、孕酮、孕烯醇酮、17a-羥孕酮和17-羥孕烯醇酮； 采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測經(jīng)過預(yù)處理的血清中的上述10種類固醇激素， 先利用高效液相色譜將10種類固醇激素分離，再利用質(zhì)譜同位素內(nèi)標(biāo)定量法，以標(biāo)準(zhǔn)品與 內(nèi)標(biāo)物的濃度比為X軸，標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為Y軸，建立校準(zhǔn)曲線，計(jì)算上述10種 類固醇激素的含量，具體色譜條件為： (1) 高效液相色譜條件： 流動相A:0. 1%v/v甲酸水溶液； 流動相B:0. 1%v/v甲酸的甲醇溶液； 色譜柱型號：PhenomenexC18 100mmX2.1mm，2.6iim; 采用梯度洗脫的方式，見表1; 流速為〇. 5mL/min，柱溫為35°C，進(jìn)樣體積為20yL; 表1流動相梯庠洗脫參數(shù)
(2) 質(zhì)譜條件： 在電噴霧電離正離子檢測模式下，采用多反應(yīng)監(jiān)測的質(zhì)譜掃描模式；噴霧電 壓為5500V;碰撞氣為Medium;氣簾氣為40kPa;離子源霧化氣和加熱輔助氣均為 60kPa;去溶劑溫度為550°C;同時監(jiān)測了目標(biāo)物孕酮（m/z345.093 - 124.1)、孕烯醇 酮（m/z332. 0 - 86. 2)、17a-羥孕酮（m/z 361. 0 - 112. 2)、17_ 羥孕烯醇酮（m/z 348.0 - 330. 3)、雄烯二酮（m/z317.0- 112. 2)、脫氫表雄酮（m/z304.2 - 253. 2)、睪 酮（m/z304. 1/112. 2)、雙氫睪酮（m/z306. 2 - 81. 1)、皮質(zhì)酮（m/z410. 0 - 377. 2)和 雌酮（m/z286. 0 - 253. 0)以及同位素內(nèi)標(biāo)d2-雌酮（m/z288. 0 - 255.I)、d6-脫氫 表雄酮（m/z310. 3 - 219. 2)、d8-17a-羥孕酮（m/z 269. 2 - 115. 1)和d3-睪酮（m/z 307. 0 - 112. 2);各個目標(biāo)物的去簇電壓、碰撞電壓和碰撞池出口電壓參數(shù)見表2 ; 表2 10種類固醇激素質(zhì)譜參數(shù) ?a
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測血清中10種類固醇激素 的方法，其特征在于，所述的血清為人或動物的血清。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測血清中10種類固醇激素 的方法，其特征在于，所述的經(jīng)過預(yù)處理的血清按照如下方法制備得到：取200yL血清于 1. 5mL離心管中，向其中加入20yL100ng/mL混合內(nèi)標(biāo)液B，再加入600yLMTBE，然后渦旋 數(shù)秒后振蕩15min，14000r/min離心5min后取400yL上清液用氮吹儀吹干，再加入80yL 1. 5mol/L羥胺，渦旋5秒后振蕩15min，放入恒溫箱60°C衍生化反應(yīng)lh。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測血清中10種類固醇激素的 方法，其特征在于，所述的混合內(nèi)標(biāo)液B按如下方法制備得到：分別準(zhǔn)確稱取10.Omg氘代同 位素內(nèi)標(biāo)品，包括d6-脫氫表雄酮、d3-睪酮、d8-17a-羥孕酮、d2-雌酮和d9-孕酮，分別 加入10mL甲基叔丁基醚完全溶解，得到濃度均為1.Omg/mL的5種同位素內(nèi)標(biāo)溶液，然后用 甲醇將這5種同位素內(nèi)標(biāo)溶液的濃度均由1.Omg/mL稀釋至1. 0yg/mL，接著各取lmL濃度 為1. 0yg/mL的5種同位素內(nèi)標(biāo)溶液加水定容至10mL，配制得到濃度均為100ng/mL的混合 內(nèi)標(biāo)液B。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測血清中10種類固醇激素的 方法，其特征在于，所述的標(biāo)準(zhǔn)品按照如下步驟制備得到： 分別準(zhǔn)確稱取脫氫表雄酮10.Omg、睪酮25.Omg、雙氫睪酮5. 2mg、雄稀二酮1. 5mg、雌 酮2. 5mg、皮質(zhì)酮2.Omg、孕酮10mg、孕稀醇酮5.lmg、17a-輕孕酮l〇mg和17-輕孕稀醇酮 25mg，分別加入lmL、2. 5mL、5. 2mL、l. 5mL、2. 5mL、2mL、lmL、5.lmL、10mL和 2. 5mL的甲基叔丁 基醚，配制成濃度分別為10.Omg/mL的脫氫表雄酮、10.Omg/mL的睪酮、1.Omg/mL的雙氫睪 酮、1.Omg/mL的雄稀二酮、1.Omg/mL的雌酮、1.Omg/mL的皮質(zhì)酮、10.Omg/mL的孕酮、1.Omg/ mL的孕稀醇酮、1.Omg/mL的17-輕孕酮和10.Omg/mL的17-輕孕稀醇酮的標(biāo)準(zhǔn)品母液； 分別從以上脫氫表雄酮、睪酮、孕酮和17-羥孕烯醇酮標(biāo)準(zhǔn)品母液中移取100yL用甲 基叔丁基醚定容至lmL，得到這10種類固醇激素的濃度都是1.Omg/mL，然后用甲醇將這10 種類固醇激素的濃度由1.Omg/mL逐級稀釋至1. 0yg/mL; 分別取200yL濃度為1. 0yg/mL的雄烯二酮、17a-羥孕酮、孕烯醇酮、雌酮和雙氫睪 酮，800yL濃度為1.0yg/mL的脫氫表雄酮，各l.OmL濃度為1.0yg/mL的睪酮、孕酮和皮 質(zhì)酮，500yL濃度為1.0yg/mL的17-羥孕烯醇酮均加入到15mL離心管中，再加去離子水 定容到10mL，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)液A;混合標(biāo)準(zhǔn)液A中，雄烯二酮、17a-羥孕酮、孕烯醇酮、雌 酮和雙氫睪酮的濃度為20ng/mL，脫氫表雄酮的濃度為80ng/mL，孕酮、睪酮和皮質(zhì)酮的濃 度為100ng/mL，17-輕孕稀醇酮的濃度為50ng/mL; 移取100yL混合標(biāo)準(zhǔn)液A于1. 5mL離心管中，向其中加入100yL空白血清基質(zhì)作為 第一個高值濃度點(diǎn)；移取40yL混合標(biāo)準(zhǔn)液A用血清基質(zhì)類似物定容至400yL得到標(biāo)準(zhǔn)混 合液B;分別取5、25、50、100、200yL標(biāo)準(zhǔn)混合液B定容至200yL，得到其它五個校準(zhǔn)濃度 點(diǎn)，這六個濃度點(diǎn)體積均為200yL;接著向其中各加入20yL100ng/mL混合內(nèi)標(biāo)液B，再加 入600yL甲基叔丁基醚，然后渦旋5秒后振蕩15min，14000r/min離心5min后取400yL 上清液用氮吹儀吹干，再加入80yL1. 5mol/L羥胺，渦旋5秒后振蕩15min，再放入恒溫箱 60°C衍生化反應(yīng)lh。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測血清中10種類固醇激素的 方法，其特征在于，所述的空白血清基質(zhì)為40mg/mL牛血清蛋白水溶液。
【專利摘要】本發(fā)明公開了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測血清中10種類固醇激素的方法，所述的10種類固醇激素分別為：脫氫表雄酮、睪酮、雙氫睪酮、雄烯二酮、雌酮、皮質(zhì)酮、孕酮、孕烯醇酮、17α-羥孕酮和17-羥孕烯醇酮；采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測經(jīng)過預(yù)處理的血清中的上述10種類固醇激素，先利用高效液相色譜將10種類固醇激素分離，再利用質(zhì)譜同位素內(nèi)標(biāo)定量法，以標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物的濃度比為X軸，標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為Y軸，建立校準(zhǔn)曲線，計(jì)算上述10種類固醇激素的含量。本發(fā)明方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確且前處理過程較簡單，10min之內(nèi)可完成多種激素的分離和檢測，精密度與加標(biāo)回收率基本滿足要求。
【IPC分類】G01N30-02
【公開號】CN104807921
【申請?zhí)枴緾N201510264590
【發(fā)明人】周亞飛, 于嘉屏
【申請人】上海迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年5月21日